养殖101班,刘东,521091112.doc

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1、第 18 页 共 17 页三种弧菌多联卵黄抗体疫苗制备及免疫效果研究 学 院： 海洋学院 专业班级： 水产养殖101班 学生姓名： 刘 东 学 号： 521091112 指导教师： 张晓君（教授） 2012年5月 连云港毕业设计（论文）中文摘要三种弧菌多联卵黄抗体疫苗制备及免疫效果研究 摘 要：伴随着集约化、大密度、工厂化水体养殖的迅速发展，海水养殖行业遭受很多细菌性、病毒性疾病，寄生虫等的困扰，因此严重影响了我国海水养殖业的迅速发展。其中细菌性病原是危害养殖鱼类的一类主要菌群，每年给我国渔民带来巨大的经济损失。很多年来一直使用广谱抗生素，如今在很多虾蟹育苗场仍然使用水产上禁用的渔药，如孔雀石

2、绿等，造成了很多病原菌的抗药性不断增加，且这些药物残留对水环境的污染日益加重，另外，药物残留不仅会在水产动物体内残留，而且还会通过富集作用残留在人体内，最终严重影响人类的健康。 卵黄免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin，IgY)可治疗由病毒、细菌等引起的人类、动物疾病，具有很高的安全无性、不产生抗药性、服用简便等优点，提供营养。在预防水产动物病害的爆发，水生动物疾病的治疗，具有广阔的应用前景。 本论文针对海水鱼类频发的细菌性疾病，尤其是高死亡率的弧菌病进行了多联卵黄抗体的制备。以纯培养的哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）、鳗弧菌（V.anguillurm）、副溶血弧

3、菌（V.heamolyticus）为抗原，通过三种弧菌免疫蛋鸡，收集卵黄。通过试管沉淀法测定卵黄抗体的效价，结果表明在蛋鸡免疫4周后，卵黄中抗体的数量不断增加，能够不断持续到第8周，抗体效价最高可达220。 将研制的卵黄抗体添加到半滑舌鳎配合饲料中投喂，投喂3,8,12,24h后取鱼的血液、脾脏、肾脏、肝脏、肠粘膜，用酶联免疫吸附试验（ELISA） 检测卵黄抗体的代谢吸收情况，结果表明，IgY经口服后很快到达直肠，继而血淋巴中也出现抗体，并可持续12 h，肝胰、肾脏、脾脏也可出现抗体，但浓度稍低。取溞状幼体、糠虾幼体、仔虾分别投卵黄，对照组喂虾片，分别接种2ml、10ml的鳗弧菌、副溶血弧菌、

4、哈维氏弧菌。结果表明，注射菌液在投喂卵黄的情况下，与投喂虾片相比较能够显著降低死亡率。三联卵黄抗体对鳗弧菌的保护作用，蚤状幼体的死亡率降低41.4%，糠虾幼体降低42.6%，仔虾降低37.3% 。三联卵黄抗体对哈维氏弧菌的保护作用，蚤状幼体的死亡率降低27.3%，糠虾幼体降低31.3%，仔虾降低29.4% 关键词：弧菌；卵黄抗体；效价测定；免疫效果毕业设计（论文）外文摘要Three kinds of vibrio multigang yolk antibody vaccine preparation and immune effect researchAbstract:Along with t

5、he rapid development of the intensive , high -density and factory-water farming , aquaculture industry has suffered much bacterial , viral disease, parasites and other problems, which therefore has a serious impact on the rapid development of Chinas marine aquaculture industry. Bacterial STDs harm w

6、hich was originally a principal flora of farmed fish , have resulted in the huge economic losses of aquaculture industry in annual year. It has been using of broad-spectrum antibiotics for many years, and now banned fishery drugs are still used on many crabs aquaculture hatcheries, such as malachite

7、 green ,which it results in the improving of the resistance to pathogens , and these drug residues have also increased pollution of the water environment .In addition , drug residues will residue not only in aquatic animals , but also in the human body through the way of enrichment , which ultimatel

8、y seriously affects the health of human.Yolk immunoglobulin (Egg yolk immunoglobulin, IgY)can treat human, animal diseases which is induced by viruses, bacteria and other causes.Yolk immunoglobulin is of high security asexual , no resistance , simplicity in using , to provide nutrition. So,in preven

9、tion, treatment aquatic diseases aspect , it has a very broad application prospects . This thesis, mainly aims at frequent bacterial disease of marine fish , and especially high mortality vibriosis were prepared by multi-joint yolk antibodies. Treating pure cultures of Vibrio harveyi , Vibrio anguil

10、larum (V.anguillurm), Vibrio parahaemolyticus (V.heamolyticus) as antigen collects yolk throngh three Vibrio immune hens . Determination the titer of egg yolk antibody by tube precipitation method , the results show that the number of the egg yolk antibodies can be increasing after four weeks of imm

11、unization in laying hens, which can will be continuing until the first eight weeks, with the titers of the antibody up to 220. Adding the egg yolk antibody to the feeding of the Gnther to feed , fish feeding after t 3,8,12,24, hakes the blood , spleen, kidney, liver, intestine. Detecting the metabol

12、ic absorption of yolk antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) , the results show that IgY quickly arrives the rectum after oral administration , and then there exsits hemolymph antibodies and it will be sustainable for 12 h.Liver and pancreas, kidneys, spleen may also occur antibodie

13、s, but the density is lower . Zoea mysid shrimp larvae , larvae taked were respectively casted into yolk ,and at the same time the control group fed prawn crackers, were inoculated with 2ml, 10ml eel Vibrio parahaemolyticus , Vibrio harveyi.Keywords: vibrio; Egg yolk antibody; Titer determination; i

14、mmune effect 目 录1 前言 51.1水生动物病原弧菌的研究51.2 细菌疫苗研制及产业化开发国内外发展趋势与现状.61.3卵黄抗体特性及其应用71.4研究目的及意义82 仪器与试剂92.1 仪器设备92.2 试剂与培养基93 试验方法103.1 供试菌株103.2免疫原的制备103.3油乳剂灭活疫苗的研制 103.4油乳剂灭活疫苗免疫产蛋鸡113.5卵黄抗体的检测113.6卵黄抗体的效价测定113.7 卵黄抗体饲料的制备123.8卵黄抗体吸收代谢试验123.9 三种病原菌高免卵黄抗体免疫保护力124 分析与结果134.1卵黄抗体试管凝集效价134.2卵黄抗体吸收试验144.3三联

15、卵黄抗体的免疫保护效果145结论155.1三种弧菌多联卵黄抗体的制备155.2卵黄抗体的吸收及代谢165.3卵黄抗体对人工感染弧菌病的保护作用16参考文献16致谢171前言鱼类疾病的原因包括营养因素，环境因素和传染性病原体如细菌，病毒，寄生虫等。 细菌感染引起的疾病具有流行的面广，持续时间长，发病率高，危害大等特点，一直是科研人员研究的重点。大约有40种海洋鱼类病原菌已报道， ，主要病原菌有弧菌（Vibro）、爱德华氏菌（Edwardsiella）、巴斯德氏菌（Pasturella）、屈桡杆菌（Flxibacrer）、气单胞菌（Aeromonads）、假单胞菌（Psuedomonas）、肾杆菌

16、（Renibacrerium）、链球菌（Strptococcus）、分枝杆菌（Mycobacterium）、诺卡氏菌（Nocardia）等（Austin和Austin,1987；Fryer和Rohovec,1993）13。1.1水生动物病原弧菌研究弧菌是引发海水养殖鱼类高死亡率的最重要的病原菌之一。由弧菌引起的疾病具有流行面积广,发病率高,持续时间长，危害大等特点。第九版伯杰氏细菌学手册收录了30多种弧菌属细菌,在这些弧菌之中,很多种已被认为是引起鱼类疾病的重要致病菌。目前在海水鱼类发现的弧菌病原主要有鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(V.parahaemolytic

17、us)、哈维氏弧菌(V. harveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、灿烂弧菌(V.splendidus)、创伤弧菌(V.vulnificus)、杀鲑弧菌(V.salmonicida)、海利斯顿氏菌(V. pelagius)、美人鱼弧菌(V.damsela)、鲨鱼弧菌(V.carchariae)以及拟态弧菌(V.mimicus)、病海鱼弧菌（V.ordalii）、海产弧菌（V.marinus）、 黏液弧菌（V.visosus）、竹荚弧菌（V.trachuri）和鱼肠道弧菌（V.ichthyobnteri）等多种弧菌可以引起鱼类病害(Austin和Austin, 1987；Fr

18、yer和Rohovec, 1993;Lunder等，1995；Ishimaru等，1996)1。 1.1.1 鳗弧菌 鳗弧菌在海水鱼类病原最大的细菌病原体，鳗弧菌属于革兰氏阴性菌，具鞭毛，有运动能力，广泛分布于自然界， 当水体温高，营养物质丰富时，鳗弧菌繁殖速度急剧增加，数量增加，可引起很多水产经济动物特别是养殖鱼类的流行性疾病。水生动物病害中病原菌鳗弧菌流行可在世界范围引起，可感染，虹鳟鱼，鳗鱼，鲈鱼，鳕鱼，鲽鱼，黄鱼14。 鳗弧菌是条件致病菌，当水产养殖动物在不良的环境条件下，遭遇不利刺激或是受伤时，会诱发疾病的产生。研究人员报道，一些受感染的鳗弧菌鱼体首先出现在体表褪色，鳍条充血，肛门红

19、肿， ，继而肌肉组织有弥撒性或点状出血，体表发黑，鳍部出现溃烂；解剖检验时有明显的黄色粘稠腹水，肠粘膜组织腐烂脱落，部分鱼肝脏坏死15。 鳗弧菌的感染途径有多种，主要包括皮肤、鳃、侧线以及肠道等。鳗弧菌感染可引起全身性病变 ，不同的鱼感染弧菌会有不同的症状，但主要症状是出血。感染鳗弧菌的养殖牙鲆最明显的症状是鳍部严重出血以及体表溃烂16。感染了鳗弧菌的大菱鲆，出现全身性的出血性败血症，鳍基部出血，眼球突出，角膜混浊，肝脏苍白，有时伴有腹水症状。Olsson等(1998)对大菱鲆的感染机制的研究表明,肠道是鳗弧菌感染的最重要的入口。鳗弧菌感染能够引起全省性组织病变。21.1.2 哈维氏弧菌 哈维

20、氏弧菌是在海洋及盐湖环境中分布极为广泛的一种致病性嗜盐细菌，其主要特性为革兰氏阴性，呈杆状或短杆状，有的略有弯曲，具极生鞭毛运动，TCBS上能生长，菌落呈黄色或绿色，隶属弧菌科中的弧菌属。哈维氏弧菌是鱼、虾、贝等水产经济动物的主要致病菌之一，已经被证实是大黄鱼弧菌病的主要致病菌，也容易感染大菱鲆、鲈鱼等。因为他们广泛存在于天然水和海水养殖区，往往造成大量的水生经济动物死亡，带来巨大的经济损失。 感染病鱼的主要症状为皮下出血,肛门发红,头颅两侧、尾鳍末端以及体侧出现红斑,并逐渐发生溃烂;解剖发现病鱼肝肾肿大,肠壁充血并有黄绿色粘液从肛门溢出。一般从体表出现出血症状后,16d便死亡,为急性感染;流

21、行时间以夏季高温期为主,89月份为高峰期。幼鱼与成鱼均会感染此病。哈维氏弧菌也是条件致病菌,在一定条件下,它们会大量繁殖成为优势菌群,通过口或伤口感染,致使伤口肌肉糜烂化脓以及内脏器官的严重病变而导致鱼的死亡。 1.1.3 副溶血弧菌 副溶血弧菌是一种嗜盐性细菌，因此在无盐培养基上不能生长，存在于近海岸的海水、海底沉积物及鱼类和贝类等海产品中。食用了被副溶血弧菌感染的的海鲜能引起食物中毒，是我国沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌。病人的主要临床症状有水样腹泻和腹部痉挛性疼痛；严重者可引起败血症；其它组织偶尔会产生病变。目前研究认为，副溶血弧菌的致病力包括细菌产生的毒素(溶血素、尿素酶)和侵袭

22、力。1.2 细菌疫苗研制及产业化开发国内外发展趋势与现状Duff于l942年首次将灭活的鲑鱼产气单胞菌口服免疫应用于硬头鳟获得成功，从而开创了渔用疫苗的新纪元。在20世纪70年代中期，欧美等积极开展渔用疫苗的研制，20世纪70 年代末，由荷兰英特威公司率先在世界上推出了首例防治鲑鱼弧菌病(Vibriosis)和肠红嘴病(Enteric Redmouth Disease)的福尔马林细菌性灭活疫苗，通过浸泡给药，有效抑制了弧菌病的爆发和蔓延，在北美鲑鱼养殖生产中取得了巨大的商业成功，开启了世界鱼类疫苗的商业化进程。1975年，美国疫苗有限公司获准生产商业性渔用疫苗。1988年，挪威法玛克公司首先在

23、欧洲开发出抗冷水弧菌病的细菌灭活疫苗，并因此拯救了挪威的三文鱼产业。随后，面对欧洲鲑鱼养殖业的另一重大病害疖点病(Furunculosis)的困扰，1991年法玛克公司开发的世界首例疖点病细菌灭活鱼疫苗获得欧洲商业许可。在随后的十年中，以这两家公司为代表，相继商业开发出弧菌病、疖点病、传染性胰腺坏死病等的三联、四联、五联和六联疫苗。而瑞典诺华动物保健公司则在病毒性疫苗的商业开发上占据优势，相继开发出世界上首例传染性鲑鱼贫血病(Infectious Salmon Anaemia，ISA)病毒疫苗和传染性造血坏死(Infectious Haematopoietic Necrosis，IHN)病毒病

24、疫苗。这些疫苗的陆续上市和广泛应用，使得欧洲的鲑鱼养殖业病害得到有效控制，并显著降低了抗生素在水产养殖业中的使用量，使挪威乃至整个欧洲的鲑鳟养殖业摆脱了对抗生素的依赖。在1990年代前，各种商业化的鱼疫苗开发主要由各水产养殖国的本土小型公司承担。其后通过各种国际兼并购的跨国资本运作，逐渐形成了以荷兰英特威（Intervet）国际公司(2008年被美国先灵葆雅动物保健公司收购)、瑞典诺华（Novartis）动物保健公司、挪威法玛克（Pharmaq）动物保健公司和德国拜耳（Bayer）动物保健公司为代表的几家跨国公司垄断的市场运作局面。他们的疫苗产品目前主要针对北欧、智利、加拿大和美国的鲑鱼及鳟鱼

25、养殖市场。进入21世纪后，随着基因工程技术的日渐成熟和安全性认知的深入，以基因工程疫苗为主要特征的鱼疫苗陆续被商业许可。2001年，世界上首例由荷兰英特威公司开发的鲶鱼肠败血病减毒活菌疫苗获得美国农业部商业许可，用于预防美国鲶鱼养殖业中的爱德华氏菌病。2005年，该公司又在美国上市了鲶鱼柱形病(Columnaris)减毒活疫苗，每年可挽回病害损失至少8000万美元。另一方面，针对鳕鱼、欧洲鲈鱼、鲷类等新兴养殖品种的出现，疫苗商业开发的重点逐渐转移到新鱼种上。2003年，英特威公司的大西洋鳕鱼弧菌病疫苗在挪威上市，2005年，黄鰤鱼弧菌病疫苗进入日本市场。法玛克公司紧随其后推出鳕鱼弧菌病三联疫苗

26、。2004年，德国拜耳公司则在智利市场成功上市了立克次氏体败血症灭活疫苗。同时，联苗的更新换代以及在智利、英国、爱尔兰、加拿大等鲑鱼养殖主产国的商业许可拓展成为各疫苗公司的主要开发内容。挪威法玛克公司和荷兰英特威公司相继于2001至2010年间先后在智利、加拿大、英国、冰岛、芬兰、丹麦、爱尔兰、希腊登国获得弧菌病、疖点病、IPN病毒病、PD病毒病、立克次氏体败血症等单联和多联疫苗的市场准入。亚洲地区已成为水产疫苗跨国公司竞相争夺的最后一片市场。 1.3卵黄抗体特性及其应用卵黄免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin)简称IgY，是一种存在于卵黄中的IgG，因此又称之为卵黄抗体

27、。目前研究较多的是鸡卵黄抗体，Williams等(1962)研究发现，用某种抗原免疫产蛋母鸡后，鸡血清中可产生相应的抗体，产蛋母鸡又能以产蛋的方式将血清中IgG有效地转移至卵黄中4。根据需求采用不同的抗原对产蛋母鸡进行免疫，就会产生针对该抗原的特异性抗体。1.3.1 卵黄抗体的理化特性IgY的物质稳定5，经l：20稀释的IgY与lmolLHCL作用30 min后活性降低一半，作用60 min后活性才完全消失。证明IgY具有较强的耐酸能力。IgY在pH值4ll范围内均比较稳定，因而可抵抗幼龄动物的胃酸屏障，幼畜口服的卵黄抗体制品能通过消化道，在到达肠道时仍能保持足够的活力以抑制病原菌的侵袭；室温

28、下IgY可保持6个月的活性，4贮存5年活性下降极少，65时IgY可保持活性24h以上，所以60，30min条件下巴氏消毒不影响lgY的活性，煮沸10min以上IgY活性才完全消失，此外研究表明IgY能很好地耐受反复冻溶，说明IgY耐热范围比较广。IgY还具有较强的抗离子强度和二定的抗酶降解能力，对胃蛋白酶有较高的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感61.3.2卵黄抗体的免疫学特性正常lgY的分子量约为180 KDa，由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成，重链分子量6570KDa，轻链分子量1921 KDa。相对于传统哺乳动物的抗体IgG，卵黄抗体IgY的免疫学特性有以下特点：IgY不结合细菌和哺乳

29、动物的Fc受体，不结合金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，也不结合链球菌G蛋白(SPG)，不激活哺乳动物的补体系统，不结合类风湿因子，故使用IgY抗体作为免疫学工具可避免干扰现象，减少假阳性的产生。鸡蛋的生产成本低，卵黄抗体提纯技术成熟，无需采血，无损伤，能够大量生产抗体又不违背动物福利原则。由于禽类与哺乳动物系统发育的差距，两者的亲缘关系较疏远，哺乳动物的蛋白质抗原在禽体内更易产生特异性高的抗体，易于提纯。IgY产量高，据Anders推算1只蛋鸡每周的抗体产量相当于910只小白兔的抗体产量。服用IgY安全可靠，对肠道正常菌群无副作用，不存在药性和药物残留问题。1.3.2卵黄抗体的应用 卵黄抗体作

30、为一种具有生物活性的免疫球蛋白，具有较好的稳定性，耐酸、耐碱、耐热特性。胃液对干粉抗体效价影响不大，口服卵黄抗体不会遭到破坏；此外，卵黄抗体还具有良好的加工和储存性能，卵黄抗体制成喷雾干燥粉，正常喷出的干粉抗体滴度与卵黄液一致；卵黄抗体较易保存，在4条件下存放5年或室温条件下存放6个月对抗体活性无明显影响。同酶制剂、益生素、中草药等一样，卵黄抗体作为一种安全、高效的预防与治疗性生物制剂必将被广泛应用于生产实践，实现利用外源抗体口服免疫疗法为海水养殖动物提供被动免疫。31.4研究目的及意义1.4.1海水养殖动物弧菌病的频发、暴发、并发、多发已成为养殖生产的瓶颈弧菌病是在世界各地海水养殖业中普遍流

31、行且表现危害最大的细菌性疾病，给水产养殖业造成了严重的经济损失。尤其是鳗弧菌、哈氏弧菌、解藻朊酸弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌等病原弧菌是我国海水养殖业中危害鱼的种类最多、流行地区最广、危害养殖水域类别最多、造成的损失最大的一类传染性疾病。因此系统调查研究海水养殖生产中主要病原弧菌种类，分布流行规律，为海水养殖生产中的病原弧菌检测、早期诊断以及防治奠定基础。1.4.2渔药残留直接威胁人类的生命和健康，水产养殖动物群发病的高效免疫预防迫在眉睫在水产养殖动物细菌性疾病防控方面，目前在生产中大多使用化学合成药物或抗生素类药物控制这些细菌性疾病的发生与流行，但长期的药物使用存在用药盲目性、有效面

32、窄、预防作用弱、药物在动物体中残留、耐药性微生物大量出现等很多不足。此外，长期在药物“保护作用”下使大量本应被淘汰的抗病力弱的个体存活下来且在种群中所占比例逐渐增大而导致整个群体的抗病能力下降，严重影响了养殖业的发展。另外还有一些不法者为谋取经济利益而违法使用国家明文规定的禁止药物，导致水产品中存留有害成分。我国的海产品安全形势严峻、问题突出，因渔药残留和其它有毒有害物质超标等直接威胁人类的生命和健康。因此，在当今的水产动物养殖领域，对水产养殖动物主要病害尤其是群发病的高效防控，并已构成了高效益、无公害养殖的关键所在和发展趋势。1.4.3被动免疫（直接使用抗体），对控制水产动物弧菌病的发生更具

33、优越性免疫学的研究已经表明，人及动物经特异疫苗免疫接种后，所诱导的体液免疫产生的抗体在人及哺乳类动物可以通过初乳向其子代传递，但禽则是通过卵黄向其子代传递，从而使子代在出生后的一定时间内获得相应特异免疫保护，抗御被相应病原微生物的感染。虾、蟹类对感染或抗原的反应通常是吞噬作用，科学界尚未确定虾、蟹类有无特异性免疫，因此借助于预防兽医学研究的技术和手段，研制一种全新的抗生素的代替品多价卵黄抗体疫苗，集营养、特异抗病于一体，在水产动物疾病防控方面开辟一条通过被动免疫的有效途径。该卵黄抗体生物制剂将在预防与治疗鱼类及甲壳动物疾病方面具有良好的应用前景，尤其是对苗期幼体“弧菌病”的预防与治疗更具优越性

34、。1.4.4口服免疫法省时省力, 更适宜于群体动物免疫便捷且有效给予途径的缺乏制约着渔用疫苗的广泛应用。目前水产疫苗的接种方法包括注射、口服、真空渗入、高渗技术、浸浴、喷雾等，每种方法各有利弊。浸浴等免疫接种方法操作比较困难特别对已放养的动物、疫苗的用量大且浪费严重等；注射法效果最好, 但费时费力；与其他免疫接种方法相比, 口服免疫法省时省力, 更适合于大规模的水产养殖动物，不受动物的大小及时间的限制, 对动物也不产生应激反应, 尤其易于多次重复免疫, 因而解决了鱼类等水生动物再次免疫的技术难题。因此本项研究工作，主要是针对养殖生产中危害严重的三种病原弧菌，研制全新的制品多价卵黄抗体疫苗，集营

35、养、特异抗病于一体，在水产动物疾病防控方面开辟一条通过被动免疫的有效途径，使我国海水养殖动物弧菌病的发生与流行得到有效控制，自然水生态环境得到明显改善，以提高海水养殖生产经济效益。2 仪器与试剂2.1 仪器设备表1 试验仪器设备表Tab.1 instruments of the experiment名称型号厂家恒温摇床QYC 2102C上海福玛实验设备有限公司电子天平EL104梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司冷藏冷冻箱BCD-206TDZA青岛海尔股份生化培养箱SPX-250B-Z上海博迅实业有限公司医疗设备厂双人单面净化工作台SW-CJ-2FD苏州净化微波炉P7021TP-6中国Galan

36、z立式压力蒸汽灭菌器筒01J203-04上海东亚压力容器制造有限公司台式高速离心机TG16A-WS上海卢湘离心机仪器有限公司家用搅面机器AK-1000上海精恒实验设备有限公司用具：培养皿、三角烧瓶、烧杯、接种环、酒精灯、剪刀、镊子、酒精棉、玻璃棒、试管和试管架、移液枪（200ul、1000ul、5ml）和相应枪头、EP管、记号笔、注射器（2.5ml）等。2.2 试剂与培养基2.2.1 营养琼脂杭州天和微生物试剂有限公司，250 g/瓶，38 g溶于1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，121高压蒸气灭菌20min备用。2.2.2 2216E培养基杭州天和微生物试剂有限公司生产的酵母浸出膏1克、蛋

37、白胨5克、琼脂20克、陈海水1000 mL，加热煮沸溶解，121高压蒸气灭菌20min备用。2.2.3 营养肉汤杭州天和微生物试剂有限公司，250g/瓶，准确称取22g溶于1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，121高压蒸气灭菌20min备用。2.2.5 0.5%的福尔马林和生理盐水甲醛溶液（Formaldehyde solution），分析纯AR，购自南京化学试剂一厂，调配成0.5%的福尔马林溶液；生理盐水，即0.9%氯化钠注射液，250mL，购自山东洁晶药业有限公司。2.2.6 PBS溶液 KH2PO4 0.2g，Na2HPO412H2O2.9g，NaCl8.0g，KCl0.2g，加水至10

38、00ml2.2.6 PBST溶液 KH2PO4 0.2g，Na2HPO412H2O2.9g，NaCl8.0g，KCl0.2g，Tween-20，0.5ml（0.05）加蒸馏水至1000ml2.2.7实验动物实验动物主要有蛋鸡来自连云港新浦区顺才养鸡场，半滑舌鳎来自连云港赣榆县半滑舌鳎人工养殖厂，规格在0.25Kg/尾左右，蚤状幼体、糠虾幼体、仔虾来自连云港赣榆县东顺育苗场。3 试验方法3.1 供试菌株供试鳗弧菌（BH1）分离自半滑舌鳎；哈维氏弧菌（DY1）分离自发病三疣梭子蟹大眼幼体；副溶血弧菌（JGB080708-1）分离自发病凡纳滨对虾。3.2免疫原的制备将哈维氏弧菌、鳗弧菌、副溶血、分别

39、接种于2216E培养基上, 28，摇床过夜培养24h，加入终浓度为0.3%的甲醛，28，灭活48h，离心得灭活菌体。3.3油乳剂灭活疫苗的研制 (1) 取黄芪，用蒸馏水浸泡30-60min，然后煎煮、过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，即得到黄芪浸出液；(2) 将一定量的白油加热至温度55，加入硬脂酸铝，继续加热,至70，加入司班80，直至终温120，维持此温度15 min，即制得油相，冷却备用；(3) 将灭活菌体和黄芪浸出液混合均匀，制得疫苗水相，水相中病原哈氏弧菌DY1免疫原为1010 cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL；(4) 油相和水相按2:1比例，乳化研磨5min，得到的就是油

40、乳剂灭活疫苗。3.4油乳剂灭活疫苗免疫产蛋鸡用酒精棉给鸡的颈部消毒，食指和拇指将颈背部皮肤捏起呈三形，沿三角下部刺入针头注射。采用颈部皮下注射免疫的方法免疫成年产蛋鸡，第1次免疫剂量为0.5mL，一周后按前述方法加强免疫，免疫剂量为0.5mL，一周后按前述方法继续加强免疫，免疫剂量为1mL，再一周后按前述方法再加强免疫，免疫剂量为0.5mL，用制成的油乳性灭活疫苗，共分4次给产蛋鸡进行免疫注射，共免疫4次，之后开始收集被免疫鸡所产的鸡蛋，分离出试验需要的卵黄。3.5卵黄抗体的检测3.5.1无菌检验取制备好的蛋黄液05 mL分别涂布于血琼脂平板和厌气肉汤培养基中，37培养24 h，检验是否无菌生

41、长。3.5.2急性安全性检验取小白鼠10只，体质量1822 g，雌雄各半，每只灌胃2 mL，常规饲养，观察lO d，检查是否健康成活。3.6卵黄抗体的效价测定3.6.1试管凝集反应首先用镊子夹取适量酒精棉球擦拭鸡蛋表面，用镊子轻敲鸡蛋壳，将鸡蛋打碎，把蛋清倒掉或用1000ml移液枪将蛋清吸走。用移液枪缓慢吸取蛋黄1000ml加入试管中，再加入1000ml生理盐水，充分震荡混匀。取20支试管, 第1支试管不加抗体作为对照，吸取混合液0.2mL，从第2支试管开始，每支试管中加入0.2 mL的生理盐水, 从第1管中吸取0.2mL到第2管中，充分吸打混匀，然后吸取0.2 mL的混合液加入到第3个试管中

42、 ,同法混匀后,再吸出0.2mL加入到第4管。以此类推,连续稀释到第20管,最后从第20管中吸出0.2mL弃去,重复三组。1组加入哈维氏弧菌菌液0.2ml，2组加入副溶血弧菌菌液0.2ml，3组加入鳗弧菌菌液0.2ml。这样从第1到第20管抗体的稀释比例分别为:21220混匀后将试管置于恒温培养箱（28）下24小时，之后记录抗原与抗体的反应情况。3.6.2酶联免疫法检测3.6.2.1抗原制备，参照上述3.23.6.2.2免疫卵黄抗体制备，参照上述3.43.6.2.3ELISA检测流程：1.用pH 9.6的0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液稀释抗原，加入96孔聚苯乙烯酶标反应板孔内，每孔100

43、L每个做3孔，60 烘干；2. 弃去酶标板内溶液，加250L PBST缓冲液洗涤，微震、静置2mins，洗涤5次，最后一次拍干或吸干；观察板内有无气泡，有则用枪头戳破；3.每孔加入200 L 2BSA PBST封闭液，37 封闭1 h，弃去酶标板内溶液，PBST缓冲液洗涤5次，同上；4.每孔加入100 L 最佳工作浓度的阳性抗体和阴性抗体，37 反应1 h，弃去酶标板内溶液，PBST缓冲液洗涤5次，同上；5.每孔加入100 L的羊抗兔IgG-HRP酶标抗体，37 反应1h；弃去酶标板内溶液，PBST缓冲液洗涤5次，同上；6.加新配制的TMB-H2O2底物溶液（临用前15分钟内），每孔100 L，37 避光反应20min；7.以50 L 2 molL-1 H2SO4终止反应；（15分钟内）用酶标检测仪读取OD450波长值，以判定结果。3.7 卵黄抗体饲料的制备饲料原料来自半滑舌鳎养殖场海水鱼配合饲料（舌鳎类*沉降性）,颗粒状，主要成分为:粗蛋白质50