核酸分子杂交.ppt

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1、核酸分子杂交定义 具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。种类按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种：固相杂交应用较广，包括Southern blot、Northern blot、Spot blot、in situ hybridization等。DNA HybridizationDe-and re-nature DNA DS using temperature variation一.核酸探针制备及标记v核酸探针（probe）是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段，因而可检测样品中特定的基因序列。探针v根据核酸探针的来源及性质有

2、双链DNA、单链DNA、单链RNA和人工合成的寡核苷酸探针等。用于分子杂交的核酸探针均须进行标记，带有示踪物，与靶基因杂交后，才能检测显示出杂交体信号。标记物有放射性同位素和非放射性同位素两大类。3H、35S和32P是三种较常用的放射性同位素标记物，非放射性同位素标记物较常用的是生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin，DIG）和荧光素等。(一)缺口平移标记法（Nick translation）v原理v在未标记的DNA探针溶液中加入一定量的胰DNA酶（DNase），DNA聚合酶和标记的三磷酸核苷。DNase在DNA双链上随机切开若干个带有3-OH末端的单链缺口，而DNA聚合酶发挥

3、53核酸外切酶活性从5-末端标记v切除单核苷酸；同时又具有从53的聚合作用，将标记的三磷酸核苷按53方向重新修补缺口，此新合成DNA的两条链均匀地被掺人标记物。该法适合于各种环状或线性双链DNA探针标记。标记v试剂v1.10缺口平移缓冲液v0.5mol/LTris-Cl(pH7.2）vv0.1mol/LMgSO4vv1.0mmol/L二硫苏糖醇(DTT)vv500g/ml牛血清白蛋白(BSA)v标记v2.未标记脱氧三磷酸核苷（dNTP）溶液：dTTP、dCTP、dGTP溶于50mmol/LTris-Cl(pH7.2)，终浓度为20mmol/L。v3.DNase（10ng/ml）：溶于含50g/

4、mlBSA、1mmol/LDTT、50%（V/V）乙二醇的溶液。v4.DNA聚合酶（5U/l）：溶于50mmol/LTris-Cl(pH7.2)。v5.-32PdATP：3000Ci/mmol、10Ci/l。操作步骤v1.加样：冰浴下依次加入下列试剂并混匀：v10缺口平移缓冲液2.5lv未标记的dNTP混合液1.0lvDNA（0.51g)5.0lv-32PdATP5.0lvDNase（振荡混匀）2.5lvDNA聚合酶（振荡混匀）0.5lv双蒸去离子水至体积25l操作步骤v2.反应：于1416水浴23小时。加1l0.5mol/LEDTA（pH8.0)终止反应。v3.分离：标记完毕的反应液加至TE

5、缓冲液平衡的SephadexG-50柱上（柱床体积为0.730mm）。加样完毕后，用TE缓冲液洗脱，分管收集洗脱液，每管约200l。再每管取5l点样于滤纸上液闪计数。主峰为纯化的标记探针，尾峰为未被结合的游离标记核苷酸。将主峰部分收集，20储存。v操作步骤v4.结合率的计算：vv主峰计数（CPM）v结合率=x100%v主峰计数（CPM）+尾峰计数（CPM）vv一般结合率在2030%。（二）5末端标记法v原理vDNA5末端的磷酸根，用碱性磷酸酶去磷酸化，再用T4多核苷酸激酶将-32PATP的-32P转移到DNA5端的羟基上。试剂v1.5T4多核苷酸激酶缓冲液v0.5mol/LTris-Cl(pH

6、7.6）v0.1mol/LMgCl2v50mmol/LDTTv1mmol/L精脒（Spermidine）v2.T4多核苷酸激酶溶液（1U/l）v3.碱性磷酸酶（25U/ml）操作步骤v1.DNA去磷酸化：在Eppendorf管内加5lDNA，25l50mmol/LTris-Cl(pH8.0）和20l碱性磷酸酶，37反应3060分钟。然后用酸变性碱性磷酸酶，用乙醚提取。再加1/10体积3.0mol/L醋酸钠，用乙醇沉淀。v2.将0.1mCi-32PATP放入小离心管，冻干。v3.转32P到DNA上：在含有-32PATP的小离心管内，依次加入38l去磷酸的DNA，10l多核苷酸激酶缓冲液，3l多核

7、苷酸激酶，在37反应3040分钟。v4.分离：加等体积饱和酚，离心510分钟后，取上清液到另一个小离心管内，再加500l乙醚，混匀，离心，弃去上层含有残留酚溶液，加1/10体积3.0mol/L醋酸钠。然后加双倍体积冷乙醇混合在-70中15分钟，或-20中2小时，沉淀DNA。操作步骤（三）随机引物标记法v原理v随机引物是指含有各种可能排列组合顺序的寡核苷酸混合物。目前实验室中常用的随机引物多是人工合成，其长度为6个核苷酸。标记的方法是将双链DNA变性成单链DNA，再与随机引物退火杂交，在四种脱氧三磷酸核苷存在下，由大DNA聚合酶大片段（Klenow片段）催化，从引物的3末端开始按53方向合成与模

8、板DNA互补的DNA链，如有-32PdNTP或其他示踪物的掺人，就可产生标记的DNA探针。原理v随机引物是指含有各种可能排列组合顺序的寡核苷酸混合物。目前实验室中常用的随机引物多是人工合成，其长度为6个核苷酸。标记的方法是将双链DNA变性成单链DNA，再与随机引物退火杂交，在四种脱氧三磷酸核苷存在下，由大DNA聚合酶大片段（Klenow片段）催化，从引物的3末端开始按53方向合成与模板DNA互补的DNA链，如有-32PdNTP或其他示踪物的掺人，就可产生标记的DNA探针。操作步骤v1.在Eppendorf管中，将TE溶解的30100ng纯化的双链DNA与15ng随机引物混合（总体积不超过14l

9、），置沸水中变性3分钟，再立即置冰浴中冷却；v2.迅速离心10秒，使溶液聚集于试管底部，冰浴中放置；3.冰浴中在一微量离心管中依次加入下列试剂并混匀：v10Klenow缓冲液2.5lv10dNTP2.5lvKlenow片段1.0lv-32PdCTP5.0lv4.将上述混合液加入到变性模板DNA随机引物溶液中。v5室温放置3小时以上。操作步骤v6加1l0.5mol/LEDTA（pH8.0)终止反应，并用TE缓冲液稀释反应液至100l，20保存备用。操作步骤（四）光化生物素法v原理v光化生物素是一种化学合成的生物素衍生物，分子中含有可光照活化的叠氮代硝苯基，生成活泼N基团，后者易与DNA或RNA中

10、的伯胺基发生结合反应，生成光化生物素标记核酸探针。v材料v1.光化生物素：在暗室中用灭菌双蒸水配成1mg/ml，分装后，避光下20可稳定保存46个月。v2.正丁醇或仲丁醇v3.特种光源：LYQ12-100卤钨灯操作步骤v1.暗室安全灯下，在Eppendorf管中加入125g待标记核酸（0.51.0g/mlDNA或RNA），两倍量的光化生物素（即250g），补水至50l。将反应管敞开插入冰模中，距卤钨灯光源10cm，强光照射30分钟。加100lTE缓冲液。此后操作在正常光线下。v2.加100l正丁醇（或仲丁醇），抽提两次，去上层正丁醇；v3.加1/10体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2倍体

11、积冷无水乙醇，混匀后置20过夜。v4.离心的沉淀经干燥后，溶于适量的0.1mol/LEDTA或灭菌双蒸水中，浓度为50g/ml，分装后20避光保存。操作步骤（五）DIG标记探针vDIG标记是德国BoehringerMannheim公司发展的一种非放射性标记方法。Digoxigenin-11dUTP可以通过随机引物标记结合到DNA探针或通过DNA体外转录标记到RNA探针，或通过3尾端标记结合到寡聚核苷酸探针。然后与抗地高辛抗体（antidigonigeninalkalinephosphatase）进行免疫反应，通过化学呈色检测。DIG标记法与前述同位素酶促标记法基本相同。二.斑点杂交v原理v将D

12、NA或RNA变性后直接点样吸附于固相支持滤膜上，然后用标记探针与之杂交，洗涤去除未反应探针，采用放射自显影或显色反应检测显示杂交信号，分析结果。v本节主要介绍用-32P标记DNA探针及光化生物素标记DNA探针检测DNA与RNA的斑点杂交方法。材料1 器材v同位素探测仪v自动光密度扫描仪v真空抽滤加样器vX光胶片盒（带增感屏）2.试剂v20SSC（3mol/LNaCl、0.3mol/L柠檬酸三钠）：称取175.32gNaCl，加700ml双蒸水，充分溶解后，加88.2g柠檬酸三钠，溶解后加双蒸水至1000ml，8磅高压灭菌15分钟。v去离子甲酰胺：称取11g离子交换树脂（Bio-BadAG501

13、-X8，2025目）与110ml甲酰胺混合，室温下搅拌30分钟，用Waterman滤纸过滤2次，分装后20保存。v硫酸葡聚糖（1mg/ml）：称取1mg硫酸葡聚糖干粉，溶于1ml灭菌水，20保存。v50Denhardt溶液（1%BSA、1%PVP-40、1%Ficoll-400）：分别称取1gBSA，1gPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮），1gFicoll-400（水溶性聚蔗糖），用少量双蒸水溶解混合，加双蒸水至100ml。过滤除菌，20保存。2.试剂v变性鲑鱼精DNA（10mg/ml）：称取鲑鱼精DNA（Sigma，型，钠盐）10mg放入灭菌管中，加入100mmol/LTris-HCl，5mmo

14、l/LEDTA缓冲液1ml，用超声波处理至液体透亮，完全溶解，分装后20保存。临用前置沸水浴中3分钟，然后迅速在冰浴中冷却。预杂交液中应含100g/mlDNA经变性并打断的鲑鱼精DNA。v 卵 白 素-碱 性 磷 酸 酶（A v i d i n-A K P，100U/100l）：以0.4%TritonX-100PBS液配制。使用液中Avidin-AKP浓度为12U/1ml。2.试剂v底物缓冲液：100mmol/LTris-Cl（pH9.5）、1mol/LNaCl、5mmol/LMgCL2。v底物显色液v1）50mg/mlBCIP：10mgBCIP溶于200l二甲基酰胺。v2）75mg/mlNB

15、T：15mgNBT溶于200l70%二甲基酰胺（H2O配制）。v3）底物显色液：5ml底物缓冲液+10lBCIP+10lNBT2.试剂操作步骤v-32P标记DNA探针的斑点杂交v1.样膜的制备v(1)、核酸样品的预变性v所取DNA及RNA样品的量视情况而定，一般可加1020g。v1）DNA样品：样品DNA溶于水或TE缓冲液，置沸水浴510分钟，并于冰浴中迅速冷却，使其变性。v2）RNA样品：在Eppendorf管加入下列试剂：vRNA样品10lv20SSC2lv甲醛7lv甲酰胺20lv混匀置68温育15分钟，并迅速入冰浴中至少5分钟。操作步骤v(2)尼龙膜的预处理：戴上干净手套，取尼龙膜按需要

16、剪成合适大小，并剪掉一角作为点样顺序标记。如采用手工点样，用铅笔在尼龙膜上按0.81cm2的面积标上小格。用蒸馏水浸湿，再浸入6SSC溶液中至少30分钟，将膜取出自然凉干后待用。操作步骤(3)点样v可根据情况选用手工直接点样或用真空抽滤加样器点样。点样v1)手工直接点样：用微量移液器将经变性处理的核酸样品依次点到尼龙膜的标记点上。斑点直径不要过大，应控制在0.5cm2以内。单个样品分少量多次点样，边点样边风干。点样v2)斑点（狭缝）真空抽滤加样器点样：常规方法清洗加样器后，用0.1mol/LNaOH清洗点样器，灭菌三蒸水充分冲洗，如为RNA样品则还应用DEPC处理的水充分冲洗。将尼龙膜湿润后覆

17、盖在加样器支持垫上（或为预先湿润的滤纸），小心排除气泡，尼龙膜覆盖不到的部分需用Parafilm膜封闭；重新安装好加样器，接通真空泵。加样孔内加满10SSC，真空抽滤至所有液体被抽干；关闭真空泵，然后重复抽滤一次。点样v上述经预变性处理的样品中加入2倍体积20SSC，分别加至各孔，真空抽滤。待全部液体抽干后，再加10SSC抽滤两次。待10SSC抽干后再维持真空5分钟，使尼龙膜干燥。点样v(4)固定：点样后的样膜，置滤纸上，室温自然干燥，然后80烘烤2小时固定核酸样品。固定的样膜封存于塑料袋内待用（20可保存若干月）。2.预杂交v(1)配制预杂交液：终浓度为6SSC、50%去离子甲酰胺、5Den

18、hardt液、0.5mg/ml鲑鱼精DNA和0.5%SDS。v(2)将封存样膜的塑料袋剪一斜角开口，加少量的2SSC使其湿润，弃余液。按150200l/cm2膜，加入预杂交液，去除袋内气泡，熔封塑料袋斜角开口处。将此塑料袋置恒温摇床或杂交炉中，42温育24小时。3.杂交v(1)探针变性：-32P标记的探针如为双链DNA，则需经变性处理。将标记好的探针置沸水浴中5分钟，然后迅速置冰浴中。v(2)配制杂交液：终浓度为6SSC、50%去离子甲酰胺、5Denhardt液、0.1mg/ml鲑鱼精DNA、0.5%SDS和放射性同位素探针0.5ng/l。杂交v(3)杂交：从水浴中取出塑料袋，剪去一角，弃预杂

19、交液，加入杂交液（按80l/cm2膜）及-32P标记探针。小心排除气泡，重新封好口。为防止污染，应将塑料袋外再套另一塑料袋。将杂交袋置恒温摇床或杂交炉中，42温育1620小时。4.洗膜v杂交温育结束后，剪开杂交袋一角，将杂交液倒入放射性废物容器中，剪开袋取出膜，放进装有2SSC0.1%SDS的盘中，室温摇晃漂洗5分钟。根据需要选择不同方法洗膜，去除非特异性的同位素。洗膜v(1)高严谨性漂洗：依次按下列条件漂洗：v2SSC0.1%SDS室温，215分钟；v0.1SSC0.1%SDS室温，215分钟；v0.1SSC0.1%SDS55，215分钟；洗膜v(2)低严谨性漂洗：依次按下列条件漂洗：v6S

20、SC0.1%SDS室温，215分钟；v2SSC0.1%SDS室温，215分钟；v1SSC0.1%SDS55，215分钟。5.放射性自显影v样膜经漂洗后，置干净滤纸上，吸去膜上多余水分，外面裹一层保险膜。暗室安全灯下，在胶盒中压上2张X光胶片，样膜上下各1张，盖上胶片盒80放射自显影。时间视杂交强度而定，24小时10天不等。取出胶片盒，恢复至室温。按常规冲洗X光片：显影15分钟,停显1分钟,定影5分钟,流动水冲洗10分钟，自然干燥。6.结果观察v根据曝光点（或狭缝）的有无、强弱，可以判定目的基因的有无及量的多少。利用自动灰度扫描仪扫描曝光点（狭缝），计算积分光密度值，可以进行半定量分析。（二）光

21、敏生物素标记DNA探针的点杂交v1.样膜的制备v按-32P标记DNA探针的斑点杂交方法进行。v2.预杂交v按-32P标记DNA探针的斑点杂交方法进行。v预杂交液中各组份的终浓度为：5SSC、50%去离子甲酰胺、5Denhardt液、50mmol/LNa2HPO4（pH7.0）、5mmol/LEDTA、0.5mg/ml鲑鱼精DNA。3.杂交v(1)探针变性：将标记的光化生物素DNA探针加入0.5mlEppendorf管中，置沸水中510分钟，立即置于冰浴中，使保持单链状态。杂交v(2)配制杂交液：各组分终浓度为5SSC、50%去离子甲酰胺、1Denhardt液、20mmol/LNa2HPO4（p

22、H7.0）、5%硫酸葡聚糖、0.1mg/ml鲑鱼精DNA、光敏生物素标记DNA探针20100ng/ml组成。杂交v(3)杂交：参见-32P标记DNA探针的斑点杂交。4.洗膜v取出样膜置含2SSC0.1%SDS溶液中漂洗5分钟。再按下列条件洗膜：2SSC0.1%SDS100ml，室温，320分钟；0.1SSC0.1%SDS100ml，65，330分钟；将样膜置干净滤纸上，室温自然干燥，封入塑料袋内（不立即显色可存放于20至少1个月）。5.显色v(1)封闭：将3%BSA溶液加入塑料袋内，于42温育封闭1小时。显色v(2)酶联显色反应：弃封闭液，再加入适当稀释的Avidin-AKP，置室温1530分

23、钟，不时轻微振荡。随后依次按下列条件洗膜：100mmol/LTris-HCl（pH7.5）、1mol/LNaCl；100mmol/LTris-HCl（pH9.5）、1mol/LNaCl、5mmol/LMgCl2。将膜转入新塑料袋中，加入新配制的底物显色液，在暗环境中室温下显色，时间1560分钟。6.结果判定v出现蓝紫色斑点（狭缝）者为阳性，未着色为阴性。根据着色的深浅可以判定目的基因的多少。三.Sourthern印迹杂交v原理vSourthern印迹杂交是分析DNA的一种方法，从细胞或组织中提取高分子量的DNA，用一种或多种限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得片段，从凝胶中按原来

24、位置和顺序吸印转移到固相支持膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，然后再与同位素或非同位素标记探针杂交，最后经放射自显影或显色反应进行检测。v以-32P标记DNA探针检测DNA为例，介绍Sourthern印迹杂交方法。材料v（一）器材v同位素探测仪v自动光密度扫描仪v真空核酸转移装置v紫外照相装置vX光胶片盒（带增感屏）vv（二）试剂及配制v1.0.2mol/LHClv2.变性液:0.5mol/LNaOHv1.5mol/LNaClv3.中和液:1mol/LTris-Cl（pH7.4）v1.5mol/LNaClv4、转移液:20SSC；或20SSPEv5、1mol/LTris-Cl（pH7.5）1.5m

25、ol/LNaCl操作步骤v（一）琼脂糖凝胶电泳分离基因组DNA限制性酶切片段v1、在灭菌Eppendorf管中依次加入下列试剂并混匀（以常用的30l反应体积为例）：v0.5g/l基因组DNA20lv双蒸去离子水5lv10缓冲液3lv限制性内切酶（10U/l）2lv2、12000g离心数秒，使管壁上的液珠离心至管底，以保证反应体系体积准确。v3、置37水浴保温36小时。v4、加入1/5体积的0.5mol/LEDTA终止反应。v5、依常规方法进行DNA的琼脂糖凝胶电泳。v（二）DNA的转移与固定v基因组DNA经限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳后，可将DNA从凝胶中转移至固相支持膜上，方法主要有毛细

26、管洗脱法及真空转移法。v1、毛细管洗脱法v（1）电泳结束后照相，然后切去凝胶的边角作为标记。v（2）将胶置于0.2mol/LHCl中处理10分钟，如果检测的DNA片段1kb，可适当延长时间（1020分钟）。当胶中溴酚蓝由蓝转成桔黄时，说明胶已处理完成。v（3）弃去HCl溶液，用去离子水漂洗2次。随后浸泡于数倍体积的变性液中1545分钟后（此时溴酚蓝重新变为蓝色），换用中和液处理1530分钟。v（4）取一瓷盘，加入转移液，上置一块略大于凝胶的玻璃板作为平台，玻璃板表面铺一张新华二号滤纸，滤纸的两边浸没在转移液中，去除玻璃板与滤纸之间的所有大小气泡。v（5）根据胶的大小载剪固相支持膜及滤纸片（35

27、张），同样剪去膜的一角作标志（也可用铅笔在膜下端写上有关资料，如时间、样品及所用酶等）。v（6）将膜平铺在去离子水表面，直到滤膜从下到上湿透为止，然后将其转至转移液中，至少5分钟。操作时戴手套，用平头镊。v（7）将经转移液浸泡的滤纸片12张铺到转移台上，驱逐气泡。倒上少许转移液，用大小适合的薄塑料板将胶从中和液中托起，将加样孔先接触转移台，自一端起将胶滑放到滤纸上，注意不要留下气泡。将浸泡好的膜放在胶上，使膜的上端对齐加样孔。放上23层预先浸泡过转移液的滤纸片，放上吸水纸堆至1015cm高，上面加一块平板，然后压上0.5kg左右的重物。v（8）转移持续824小时，每当纸巾浸湿后更换新的纸巾。小

28、片段转移快，大片段转移需要时间较长。v（9）转移完毕，移去吸水纸，用平头镊将膜取出，在6SSC溶液中浸泡滤膜5分钟，用滤纸印吸干后，夹在两层干净滤纸片中，置于80烤0.52小时。封入塑料袋中保存备用。v2、真空转移法v（1）安装真空转移装置v1)根据胶的大小做好塑料膜窗口，其大小略小于凝胶，每边应有310mm的重合，让胶将窗口严密地封住。但不能大于10mm，否则加入液体后，胶容易漂起来。v2)将多孔滤板安放在装置的下槽内，四边套紧气密圈，再放上塑料膜窗口。v3)将上框放上，压住窗口塑料膜的四边，夹紧四角上的锁定夹。v（2）依次放上转移膜及琼脂糖凝胶v1)膜的准备：将硝酸纤维素膜或尼龙膜裁剪成每

29、边少于窗口边缘0.51.0mm。v2)用水浸湿，再用20SSC漂浮转移膜2030分钟，尼龙膜可不预处理。v3)将膜放在窗口内，务使每边留下1mm左右的空隙。v4)用一张大小合适的薄塑料片托住凝胶，将加样孔与窗口对齐平放，然后使胶滑落在膜上，覆盖住窗口。v5)启动真空泵，使凝胶吸压在膜和塑料窗口上，检查密封效果。v（3）脱嘌呤处理：用巴氏吸管加0.2mol/LHCl于凝胶上，使覆盖整个凝胶，使真空泵负压在2030Mbar维持1020分钟，至溴酚蓝完全变色为止。吸去凝胶上面的HCl。v（4）变性处理：同法加入变性液覆盖整块凝胶，使真空泵负压在2030Mbar维持1020分钟，至溴酚蓝颜色完全复原为

30、止。吸去凝胶上面的变性液。v（5）中和处理：同法加入中和液覆盖整块凝胶，使真空泵负压在2030Mbar维持1020分钟，吸去凝胶上面的中和液。v（6）转移：从凝胶中央小心加入20SSC溶液，直至覆盖住整块凝胶，液面最好达2倍凝胶的厚度。真空负压为5055Mbar，转移时间依照凝胶的厚度、浓度而定，凝胶的厚度和浓度越高，所需时间越长，一般持续转移3060分钟。v（7）固定：转移结束，依次移去上框、剩余的20SSC、凝胶及真空垫圈，取出转移膜，不要浸泡或冲洗，转移面朝上放在滤纸上晾干。将膜夹在两层滤纸中间，80干烤固定12小时，封入塑料袋中保存备用。v（三）预杂交、杂交、洗膜、放射自显影和结果分析

31、v按-32P标记DNA探针的斑点杂交方法进行。Diagnosis of Sickle-Cell Anemia四.Northern印迹杂交技术v原理vNorthern印迹杂交的基本原理是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到尼龙膜等固相膜载体上，用放射性同位素标记的DNA或RNA特异探针对固定于膜上的mRNA进行杂交，洗膜去除非特异性杂交信号，经放射自显影，对杂交信号进行分析。将杂交的mRNA在电泳中的迁移位置与标准分子量进行比较，即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小，对杂交信号的强弱比较，可了解该基因表达mRNA的强弱。v以甲醛琼脂糖变性胶电泳分离RNA，介绍RNANorthe

32、rn印迹杂交。v材料v（一）器材v同位素探测仪v自动光密度扫描仪v真空核酸转移v紫外照相装置vX光胶片盒（带增感屏）v（二）试剂及配制v1、5甲醛电泳缓冲液v0.1mol/L3-N-玛琳（N-morpholincpropane-sulfonicacid，MOPS）（pH7.0）v25mmol/LNaACv5mmol/LEDTA（pH8.0）v将20.9gMOPS溶于800ml经0.1%焦炭酸二乙脂（DEPC）处理的水中，加8.3ml3mol/L乙酸钠，20ml0.5molEDTA(pH8.0)，用DEPC处理的水定容至1L，0.2m微孔滤膜过滤除菌，避光保存于4。溶液见光变为深黄色不能再用。v

33、2、甲醛凝胶加样缓冲液v50%甘油v1mmol/LEDTA（pH8.0)v0.25%溴酚蓝v0.25%二甲苯青FFv用0.1%DEPC37处理过夜，高压灭菌，保存于室温。v3、溴化乙锭溶液v0.5g/ml溴化乙锭v0.1mol/L乙酸铵v方法v（一）甲醛变性电泳分离RNA样品v1、电泳槽的无RNA酶处理：电泳槽用去污剂洗干净，蒸馏水冲洗，无水乙醇漂洗干净，3%H2O2处理10分钟，最后用DEPC处理过的三蒸水冲洗数遍。v2、配制1%琼脂糖变性胶：v5甲醛电泳缓冲液20mlv0.1%DEPC水80mlv琼脂糖1gv加热至胶完全溶化后，冷却至60，加入5.4ml37%甲醛，混匀并置通风橱内，将凝胶

34、倾倒入电泳槽上，于室温放置30分钟或更长时间，使凝胶凝固。v3、RNA样品处理v在Eppendorf管中加入下列试剂：vRNA样品9lv5甲醛电泳缓冲液4lv甲醛7lv甲酰胺20lv总体积40l，混匀后65温育15分钟，并迅速置冰浴中至少5分钟。5000g离心5秒使管内所有液体集中于管底。加4l甲醛凝胶加样缓冲液混合待用。v4、电泳：制备的凝胶先预电泳5分钟，再将样品加至凝胶加样孔中，同时加入已知大小的RNA混合物作为分子量标准参照物，按34V/cm电压进行电泳。电泳过程中，每隔12小时，将正负极槽内液体混合后继续电泳。v5、电泳结果观察：电泳结束后（溴酚蓝迁移出约78cm），切下分子量标准参

35、照物的凝胶条，浸入溴化乙锭溶液中染色3045分钟。在凝胶旁放置一透明尺，在紫外灯下照相，便于以后测量照片上每个RNA条带至加样孔的距离。以RNA片段大小的对数值对RNA条带的迁移距离作图，绘制标准曲线，根据标准曲线计算杂交后所检出的RNA分子的大小。v（二）变性RNA转移至尼龙膜v上述经甲醛琼脂糖变性凝胶电泳分离的RNA样品，应尽快转移至尼龙膜上，方法主要有毛细管洗脱法及真空转移法。v1、毛细管洗脱法v（1）凝胶的预处理：将凝胶移至一个干烤过的平皿内，将边缘多余部分用眼科解剖刀切去，在加样孔一侧切去一角作凝胶方位标记。并用经DEPC处理的三蒸水淋洗数次，除去甲醛。v（2）取一瓷盘，加入20SS

36、C溶液，上置一块略大于凝胶的玻璃板作为平台，玻璃板表面铺一张新华二号滤纸，滤纸的两边浸没在20SSC溶液中，去除玻璃板与滤纸之间的所有气泡。v（3）把凝胶底向上翻转覆盖在滤纸上，去除二层之间出现的气泡。用保鲜膜围绕在凝胶周边，但不覆盖凝胶，作为屏障以阻止液体自池边直接流至凝胶上方的纸巾中。v（4）裁剪一张尼龙膜，其长与宽大于凝胶11.5cm，并剪下一角做记号以定滤膜方位。先将膜在20SSC中至少润湿20分钟，然后放置在凝胶表面上，二层之间不可有气泡存在。v（5）将两张与尼龙膜一样大小经20SSC溶液润湿过的滤纸，覆盖在尼龙膜上，去除气泡。（6）把一叠约510cm高同滤纸大小一样的吸水纸放置在滤

37、纸上，在吸水纸上再放一块玻璃板和约500g的重物。v（7）上述程序就绪，RNA转移即开始进行，需持续1824小时。如果吸水纸过于潮湿，应换新的吸水纸。v（8）转移结束后，揭去凝胶上方的吸水纸和滤纸，取出尼龙膜，不必冲洗、浸泡，转移面朝上置一张滤纸上晾干。将膜夹在两张滤纸中间，80干烤固定12小时，封入塑料袋中保存待用。v2、真空转移法v（1）凝胶的预处理：具体程序同毛细管洗脱法。v（2）真空转移槽预处理：常规去污剂清洗，三蒸水漂洗数次，再用DEPC处理的三蒸水冲洗数次后备用。v（3）在转移槽的支持网上置放经2SSC湿润过的新华二号滤膜二张，去除支持网与滤膜间的气泡。v（4）裁剪一张尼龙膜，每边

38、应比凝胶大11.5cm，于2SSC中浸泡20分钟，平放在滤纸上，去除所有气泡。v（5）选取合适大小的真空垫圈（每边略小于凝胶11.5cm），覆盖住尼龙膜，调整尼龙膜的位置，使其处于真空垫圈的中间。v（6）将凝胶放置到真空垫圈上，检查凝胶四边，要与垫圈严密重叠。排除所有气泡。v（7）加上上框，固定真空垫圈。打开真空泵，调整到613kPa的压力。v（8）小心加入20SSC溶液覆盖凝胶，持续转移3小时。v（9）转移结束，依次移去上框、剩余的20SSC、凝胶及真空垫圈，取出尼龙膜，不要浸泡或冲洗，转移面朝上放在滤纸上晾干。将膜夹在两层滤纸中间，80干烤固定12小时，封入塑料袋中保存待用。v（三）预杂交

39、、杂交、洗膜和放射自显影v按-32P标记DNA探针的斑点杂交方法进行。v（四）分析结果：根据曝光显示的条带，对照RNA分子量标准参照物条带的迁移距离图，即可查出凝胶电泳中相应的RNA位置，从而知道基因转录的RNA的大小。利用自动光密度扫描仪扫描曝光的条带，计算条带的积分光密度值，以内参照RNA条带的积分光密度为校正值，可以确定不同样品基因转录的表达强度。五.原位杂交v原理v原位杂交（insituhybridization,ISH）是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术,也称原位杂交组织化学（insituhybridizationhistochemistry，ISSH）。它是利用标记的DNA或R

40、NA为探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的DNA或RNA序列的杂交技术。其基本原理是含互补顺序的标记DNA或RNA片段即探针，v在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。根据所用的探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。根据探针的标记物是否能直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法指用放射性同位素、荧光素或一些酶标记的探针与组织细胞内靶核酸所形成的杂交体可分别通过放射自显影、v荧光显微术或显色的酶促反应等直接检测。间接法指用半抗原标记探针，而探针与组织细胞内靶核酸形成的杂交体则通过免疫组织化学法对半抗原

41、的定位间接地显示。v本节主要介绍用-32P标记DNA探针检测冰冻组织切片中DNA及以地高辛标记DNA探针检测石蜡包埋组织切片中DNA的原位杂交方法。v试剂v1、0.2mol/LHCL：1.72ml浓HCL，加ddH2O至100ml。v2、0.2%TritonX-1000.1mol/LPBS：1000ml0.1mol/LPBS液中加入TritonX-1002ml，混匀，高压灭菌。v3、蛋白酶K溶液:v1mol/LTris-HCl（pH8.0）10mlv0.5mol/LEDTA(pH8.0）10mlv加灭菌水至100mlv使用前加入蛋白酶K储存液（0.5mg/ml，-20保存），使蛋白酶K的终浓度

42、为1g/ml。v4、4%多聚甲醛0.1mol/LPBS(pH7.4)：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500800ml0.1mol/LPBS(pH7.4），加热至60左右，持续搅拌使粉末完全溶解，常需滴加少许1mol/LNaOH才能使溶液清亮，再加0.1mol/LPBS至1000ml，充分混匀。v5、预杂交液v50%去离子甲酰胺v2SSCv10%硫酸葡聚糖v5Denhardt溶液v0.5mg/ml变性鲑鱼精DNAv6、-32P标记的DNA探针v7、地高辛标记的DNA探针v8、缓冲液：v顺丁烯二酸（马来酸）0.1mol/LvNaCL0.15mol/Lv用10mol/LNaOH将pH调至7

43、.5（20），高压灭菌后备用。v9、缓冲液v先制备阻断剂储存液；取试剂盒中阻断剂按10%（W/V)加入缓冲液，混匀，用微波炉加热使其完全溶解，高压消毒后4或-20保存。取上述10%的阻断剂储存液用缓冲液按1：10稀释即制成缓冲液。v10、缓冲液pH9.5（20）vTris-Cl100mmol/LvNaCl100mmol/LvMgCl250mmol/Lv11、缓冲液pH8.0(20)vTris-Cl10mmol/LvEDTA1mmol/Lv12、底物显色液v缓冲液15ml+52.5lBCIP+67.5lNBTv-32P标记DNA探针的原位杂交v（一）冰冻切片预处理v1.新鲜取材组织置液氮冷冻的异

44、戊烷中。v2.恒冷箱切片（215m），置预处理的玻片上。v3.4%多聚甲醛室温下固定1560分钟。v4.PBS洗210分钟，43烤片过夜。v5.0.2mol/LHCl室温作用10分钟，0.1%0.3%TritonX-100作用1530分钟。v6.0.2%甘氨酸的PBS室温作用10分钟。v7.蛋白酶K1g/ml37孵育1530分钟。v8.0.2%甘氨酸的PBS室温作用10分钟。v9.PBS-5mmol/LMgCl2洗210分钟。v10.逐级酒精脱水，空气干燥或直接37烤干保存。v（二）预杂交v1、切片用2SSC浸泡15分钟。再用4SSC配制（V/V）的50%去离子甲酰胺37孵育15分钟。v2、每

45、张切片加预杂交液20l，杂交温度下（如42）孵育30分钟2小时。v（三）杂交v吸弃预杂交液，每张切片加杂交液20l（含0.5ng/l-32P标记DNA探针），加盖硅化的盖玻片。玻片放置湿盒中，95100变性10分钟。取出反应盒，立即入冷水中放置15分钟，再转入42温箱中杂交1218小时，不要超过24小时。v（四）洗涤v杂交完毕，于2SSC溶液中轻轻去除盖玻片。v2SSC洗涤，室温，12分钟；v1SSC50%去离子甲酰胺洗涤，37，210分钟；v0.1SSC洗涤，40，230分钟。v（五）同位素标记探针显色法v1、暗室中将分装的核乳胶溶液（约10ml）小瓶置45水浴中浸泡至少1小时，使核乳胶完全

46、熔成液态。v2、组织切片垂直浸入熔化的核乳胶液中1分钟，使核乳胶均匀流布在标本上（垂直进入和垂直提出的速度要均匀，提出后拭去背面及下端的核乳胶）。v3、暗室中切片于45电热板上，干燥12小时。v4、切片装入暗盒内，周围以胶带封固，4曝光（3H标记探针28周，35S标记探针14周，32P标记探针710天）。v5、取出切片暗盒，室温放置至少1小时（勿启封），使其缓慢回升至室温。v6、在暗室中（可留安全灯）将切片置入Kodax19显影液35分钟，水冲洗片刻后，置KodaxF24定影液中35分钟（水温、显影液及定影液温度最好为1820）。v7、自来水冲洗载片1520分钟后，以1%苏木精染液染510分钟

47、。v8、盐酸酒精中提插2下，再用自来水冲洗510分钟返蓝。v9、0.5%1%伊红染液复染1分钟；70%、80%、95%、100%系列乙醇脱水；二甲苯透明、树脂胶封片、光镜检查。v（六）观察结果v阳性标记物呈黑色颗粒位于蓝染的细胞核或红染的细胞质内。v v v地高辛标记DNA探针的原位杂交v（一）石蜡组织切片预处理v1、43烤片过夜，75烤10分钟熔化石蜡。趁热浸入37二甲苯中30分钟，再转入新鲜二甲苯中10分钟。逐级酒精入水（100%、95%,、90%、80%、,70%各5分钟），再用甲醇洗25分钟。v2、0.2mol/LHCl室温作用10分钟，0.1%0.3%TritonX-100作用153

48、0分钟，含0.2%甘氨酸的PBS室温作用15分钟。v3、1g/ml蛋白酶K37孵育1530分钟。含0.2%甘氨酸的PBS室温作用10分钟。PBS-5mmol/LMgCl2洗210分钟。v4、4%多聚甲醛室温下固定15分钟。PBS-5mmol/LMgCl2洗215分钟。v5、逐级酒精脱水（70%、80%、90%、95%、100%各5分钟），空气干燥或直接37烘干保存。v（二）预杂交、杂交v参见-32P标记DNA探针的原位杂交，只是地高辛标记探针的浓度为2.5ng/l。v（三）洗涤v杂交完毕，于2SSC溶液中轻轻去除盖玻片。v2SSC洗涤，室温，12分钟；v2SSC洗涤，40，45分钟；v0.1S

49、SC洗涤，40，230分钟；v缓冲液洗涤，室温2分钟，振摇；v缓冲液洗涤，室温30分钟，振摇。v（四）信号检测v1、擦去组织周围的缓冲液，加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体（工作浓度为1：5001：5000，用缓冲液稀释）室温下孵育2小时。BoehringerMannheim提供的抗体，孵育时可在抗体中加1%的正常羊血清，以减低背景。v2、缓冲液洗涤，室温，215分钟。v3、缓冲液洗涤，室温，3分钟。v4、擦去组织周围的缓冲液，加显色液，室温下避光显色2小时至过夜。可在显微镜下检查显色反应，阳性反应呈深兰色。当获得满意的反应结果后，即可终止反应。v5、缓冲液洗涤，室温，5分钟。v6、缓冲液洗涤，室温，2分钟。v7、封片、光镜检查。v（六）观察结果v在细胞核或细胞浆内出现蓝紫色杂交信号为阳性。