核酸第二部分.ppt

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1、流行性感冒病毒核酸检测试剂注册申报资料技术审评指导原则（报批稿）第二部分2011.10 广西工艺及反应体系研究（1）生产工艺：工作液配制、半成品检定、分装和包装等生产工艺要求：原材料及其配比要求，物理参数：pH、电导率等要求 工艺及反应体系研究（2）主要生产工艺介绍，可以图表方式表示反应原理介绍基因位点选择、RT-PCR方法学特性介绍工艺及反应体系研究（3）RT-PCR体系优化：靶序列选择 引物、探针序列 各组分浓度 Tm值、PCR各阶段温度、时间等工艺及反应体系研究（3）基线（threshold）和阈值循环数（Ct）确定适用机型选择考虑多探针识别靶核酸 eg：H1+N1；巢式PCR（H1序列

2、）工艺及反应体系研究（4）外部对照（质控）品：至少包括临界阳性和阴性对照（质控）品；均应参与样本核酸的平行提取工艺及反应体系研究（5）各种对照（质控）品的Ct值阴性对照品：推荐采用与实际检测样本具有相同或相似性状的基质溶液工艺及反应体系研究（6）内对照（内标）：必须设置（竞争或非竞争）对内标的引物、探针和模板的浓度做精确验证Ct值要求。工艺及反应体系研究（7）对照品的原料选择：内对照（内标）：具有蛋白外壳的病毒颗粒，如灭活的流感病毒或缺陷病毒（假病毒）；外部阳性对照：可以采用灭活病毒、假病毒或质粒。分析性能评估 产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括各性能的标准要求、具体研究方

3、法、试验数据、统计方法等详细资料 建议对实验地点、操作人员、适用机型、实验条件等背景信息也作简单介绍。流感病毒核酸（RNA）提取1 目的：富集靶核酸浓度保证靶核酸序列的完整性增加PCR模板溶液均一性去除PCR抑制物分析性能评估流感病毒核酸（RNA）提取2 RNA分离纯化方法：传统方法vs改良方法满足试剂的性能需要提供详细的验证资料。分析性能评估最低检测限（分析灵敏度）（1）最低检测限的确定最低检测限的确定培养后病毒原液的梯度稀释液病毒滴度的滴定：推荐采用半数组织培养感染量(TCID50）、copies/ml、空斑形成单位（PFU）分析性能评估最低检测限（分析灵敏度）（1）最低检测限的确定最低检

4、测限的确定每个梯度重复3-5份90%-95%阳性检出率-最低检测限。分析性能评估最低检测限（分析灵敏度）（2）最低检测限的确定最低检测限的确定至少5份最低检测限水平的病毒稀释液对90%-95%的检出率进行确认。常见各甲型亚型和乙型流感病毒应至少包括不同来源的两个具有代表性的病毒株的系列稀释梯度。分析性能评估最低检测限（分析灵敏度）（3）最低检测限的验证接近最低检测限的病毒浓度每种亚型具有时间和/或区域多样性的至少3个毒株如含疫苗株，应能体现当年流感发病季的病毒特点。分析性能评估最低检测限设定最低检测限设定-举例举例1From H1N1-09 INFLUENZA TEST PACKAGE INS

5、ERTAmerican 最低检测限设定最低检测限设定-举例举例2From H1N1-09 INFLUENZA TEST PACKAGE INSERTAmerican 最低检测限设定最低检测限设定-举例举例3From H1N1-09 INFLUENZA TEST PACKAGE INSERTAmerican 最低检测限设定最低检测限设定-举例举例4From H1N1-09 INFLUENZA TEST PACKAGE INSERTAmerican 最低检测限设定最低检测限设定-举例举例5From H1N1-09 INFLUENZA TEST PACKAGE INSERTAmerican 最低检测

6、限设定最低检测限设定-举例举例6From H1N1-09 INFLUENZA TEST PACKAGE INSERTAmerican 分析特异性(1)交叉反应 流感病毒：不同型别和亚型间其他病原体（表1）：核酸序列具有同源性 易引起相同或相似的临床症状 采样部位正常寄生或易并发的其他微生物分析性能评估分析性能评估表表1 建议用于交叉反应性研究的微生物建议用于交叉反应性研究的微生物微生物微生物类型类型微生物微生物类型类型腺病毒3型棒状杆菌*腺病毒7型大肠杆菌*人冠状病毒流感嗜血杆菌巨细胞病毒乳杆菌*肠道病毒卡他莫拉菌*人副流感病毒1型无毒结核分枝杆菌人副流感病毒2型肺炎支原体人副流感病毒3型脑膜

7、炎奈瑟菌麻疹病毒淋球菌*人偏肺病毒铜绿假单胞菌*流行性腮腺炎病毒金黄色葡萄球菌呼吸道合胞病毒B型表皮葡萄球菌*鼻病毒1A型肺炎链球菌百日咳杆菌化脓链球菌肺炎衣原体唾液链球菌*项：选择性验证分析特异性(2)交叉反应 病原体滴度水平：医学相关水平，细菌为106 cfu/ml或更高，病毒为105 pfu/ml或更高产品说明书【产品性能指标】项。分析性能评估分析特异性(3)干扰物质（表2）血液、鼻分泌物或粘液、用于缓解鼻塞和咽部充血、鼻腔干燥、刺激、哮喘和过敏症状的药物。分析性能评估分析性能评估表表2 建议用于干扰研究的物质建议用于干扰研究的物质物质物质活性成分活性成分粘蛋白纯化粘蛋白人血液鼻腔喷雾剂

8、或滴鼻剂肾上腺素、羟甲唑啉、含防腐剂的氯化钠溶液鼻腔糖皮质激素倍氯米松、地塞米松、氟尼缩松、曲安西龙、布地奈德、莫美他松、氟替卡松鼻用凝胶硫磺过敏性症状缓解药物金英润喉片、口服麻醉剂和镇痛剂苯唑卡因、薄荷脑抗病毒药物扎那米韦抗生素、鼻用软膏莫匹罗星全身抗菌药妥布霉素分析特异性(4)干扰物浓度：医学相关水平 潜在最大浓度(“最差条件”)流感病毒：每种亚型的至少两种病毒株 最低检测限水平。分析性能评估精密度（1）参考：CLSI-EP文件、国内有关IVD产品性能评估文件 可能影响检测精密度的主要变量：试剂、PCR分析仪、操作者、地点等分析性能评估精密度（2）指标：批内/间、日内/间以及总的CV等评价

9、方案：企业自定合理方案 例如：连续20天（工作日），每天由2人完成不少于2次的完整检测分析性能评估精密度（3）精密度质控品：阴性质控品临界阳性质控品阳性质控品分析性能评估精密度（4）另外，选择适量临床采集的新鲜病人样本（包括所有样本类型）作为无靶值质控品进行精密度评价。分析性能评估阳性/阴性参考品（1）有国家参考品：企业内部阳性/阴性参考品应参考国家参考品的项目设置。不低于国家参考品要求分析性能评估阳性/阴性参考品（2）没有国家参考品：根据产品性能验证的实际情况自行设定企业内部参考品阳性参考品-病毒型别、亚型及滴度要求 阴性参考品-交叉反应验证。分析性能评估阳性/阴性参考品（3）申请人应对内部

10、阳性/阴性参考品的来源、型别鉴定、病毒滴度等信息进行精确的实验验证，并提交详细的验证资料。分析性能评估参考值（范围）确定资料 Ct值确认资料：建议申请人采用受试者工作特征（ROC）曲线的方式对申报产品用于结果判断的临界值予以确认。稳定性研究资料(1)试剂稳定性研究 实时稳定性、运输稳定性、开瓶（复溶）稳定性、冻融次数限制等 企业可根据实际需要自行确立合理的稳定性研究方案稳定性研究资料(2)稳定性资料：研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论 实时稳定性研究，应提供至少3批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料稳定性研究资料(3)适用样本的稳定性病毒RNA极易被降解

11、保存条件：冷藏、冷冻、冻融次数稳定性研究资料(4)适用样本的稳定性验证条件：选择3-5个温度点（上限/下限）间隔一定时间段行全性能验证 所有样本类型在对样本进行效期稳定性的评价时，同时应对推荐使用的采样拭子、样本保存液及保存容器进行合理验证。稳定性研究资料(5)试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。临床试验研究评价拟上市产品有效性和安全性的重要依据，注册必须重要文件。法规依据：体外诊断试剂注册管理办法（试行）体外诊断试剂注册申报资料形式与基本要求 提完整的试剂临床研究技术指导原则研究方法（1）已有同类产品上市，同时同时包括：

12、已上市同类产品比较（500例）“金标准”（病毒培养）方法比较，每种样本类型不少于30例阳性样本。临床试验研究研究方法（2）新型甲型流感病毒检测参比方法：病毒分离培养鉴定和/或病毒核酸序列测定方法 用于核酸序列测定的引物序列区别临床试验研究研究方法（3）已获上市批准的甲型流感病毒核酸（通用型）检测试剂注册证有效期内出现了新型甲型流感病毒的暴发流行：针对新的流感亚型开展临床比对研究，对比方法采用“金标准”方法或爆发时卫生部门认可的针对该新型甲型流感病毒亚型的诊断标准临床试验研究研究方法（4）样本：新型甲型流感病毒感染（阳性病例不少于30例）、其它常见的流感病毒亚型感染（如当年流行的季节性甲型流感病

13、毒）以及非流感病毒感染但具有流感样症状的患者的新鲜样本例数：总例数不少于100例，如结果可以证明对新型甲型流感病毒亚型的检测能力，申请人可提出增加预期用途的变更申请。临床试验研究研究单位 临床研究单位的选择：国内不同区域；呼吸道疾患诊疗和分子生物学方法检测的优势 实验操作人员应熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。临床试验研究临床试验方案（1）从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑各机构的方案设置应基本一致，整个试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动临床试验研究临床试验方案（2）整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，

14、申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程。临床试验研究临床试验方案（3）确定严格的病例纳入/排除标准采用盲法临床试验研究临床试验方案（4）各单位间参比试剂应一致考核试剂的样本类型不应超越参比试剂对样本类型的检测要求临床试验研究病例选择（1）目标人群：具有流感症状/体征(例如：咳嗽、鼻塞、鼻漏、咽喉疼痛、发烧、头疼、肌痛)的人群具有流感相似症状的人群有密切接触史的人群 临床试验研究病例选择（2）覆盖各个年龄段人群 患者流感症状出现后，流感病毒在鼻腔或气管分泌物中的浓度在24-48小时内将保持较高水平，但在不同年龄段人群可能有一定差异，在儿童体内的持续时间更长。临床试验研究病

15、例选择（2）对于新型甲型流感病毒亚型，目标人群：新型甲型流感病毒感染者及密切接触者其它当年流行的季节性流感病毒感染患者非流感病毒感染但具有流感样症状的患者等对于阴性病例的选择，也应考虑到交叉反应的需要，以从临床角度考察其分析特异性 临床试验研究样本类型应为实际临床检测中常用的样本类型每种样本类型应有不少于100例的阳性病例临床试验研究统计学分析选择合理的统计学方法结果可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异交叉四格表总结两种试剂的定性检测结果四格表卡方或kappa检验临床试验研究结果差异样本的验证 应采用“金标准”方法或临床上普遍认为质量较好的第三种同类试剂进行验证，结合临床分析差异。临床试验研究临床试验报告（1）临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法临床试验研究临床试验报告（2）临床试验的整体设计及各个床试验总体设计及方案描述具体的临床试验情况临床试验研究临床试验报告（3）统计学分析考虑到对不同样本类型以及不同年龄段人群的检测结果可能存在一定差异，故建议对不同样本类型及不同年龄段(例如：小于5岁、6-21岁、22-59岁和60岁以上)人群分别进行统计分析，以对考核试剂的临床性能进行综合分析。讨论和结论临床试验研究ThanksThanks