细胞凋亡及检测方法.ppt

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1、细胞凋亡及凋亡检测细胞凋亡及凋亡检测2011-2-25一、概述一、概述 细胞凋亡细胞凋亡(apoptosis)：由体内外因素触发细胞内：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡（又称为程序性细胞死亡）凋亡（又称为程序性细胞死亡） 1972年由年由Kerr等建议用来描述伴随细胞死亡的一等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的。系列形态学上固定的变化形式的。“凋亡凋亡”一词一词来自希腊语，来自希腊语，apo意为意为“分离分离”，ptosis指花瓣指花瓣或树叶的脱落，或树叶的脱落，“凋亡凋亡”是由这两个词组合而成

2、，是由这两个词组合而成，意指细胞凋亡类似秋天花瓣或树叶的凋落一样意指细胞凋亡类似秋天花瓣或树叶的凋落一样研究简史研究简史 半个世纪前半个世纪前:人们就观察到生理自发退化死亡现象人们就观察到生理自发退化死亡现象. 1965年年:发育生物学家发育生物学家Lockshin和和Williams首先提出了首先提出了PCD（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程 1972年年:Kerr等首次提出了细胞凋亡的概念等首次提出了细胞凋亡的概念 1977年年:人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细胞人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。发育过

3、程中的凋亡现象。 1980年年:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征，包括凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征，包括核固缩和核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等降解成寡核苷酸片段等 1989年年: 0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中证明了信号传递物质对证明了信号传递物质对PCD的调控作用。的调控作用。 1991年年:Ellis首先发现了线虫首先发现了线虫(C.elegans)体内体内Ced-3、4两个两个基因与基因与PCD的发生密切

4、相关，随后逐渐发现了多种参与的发生密切相关，随后逐渐发现了多种参与PCD的正相调节基因和负相调节基因的正相调节基因和负相调节基因19701975198019851990199520002005020004000600080001000012000Thirty years on apoptosispublications细胞死亡的形式细胞死亡的形式 坏死坏死：活体组织细胞的死亡活体组织细胞的死亡 凋亡凋亡细胞凋亡与坏死的比较细胞凋亡与坏死的比较坏死 凋亡 性质诱导因素生化特点形态变化DNA电泳炎症反应凋亡小体基因调控病理性、非特异性 强烈刺激，随机发生被动过程，无新蛋白合成细胞肿胀、细胞结构全面

5、溶解、破坏弥散性降解，电泳呈均一DNA片状 溶酶体破裂，局部炎症反应无无 生理性或病理性，特异性较弱刺激，非随机发生主动过程，有新蛋白合成胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩DNA片段化（180-200bp）电泳呈梯状条带溶酶体相对完整，局部无炎反应 有有坏死坏死坏死炎细胞浸润坏死炎细胞浸润凋亡凋亡细胞凋亡的生理病理意义细胞凋亡的生理病理意义 确保正常发育、生长：清除多余的、失去功确保正常发育、生长：清除多余的、失去功能价值的细胞（指趾间组织细胞）能价值的细胞（指趾间组织细胞） 维持内环境稳定：清除受损突变细胞，自身维持内环境稳定：清除受损突变细胞，自身反应细胞，衰老细胞反应细胞，衰老细胞 发

6、挥积极的防御功能：病毒感染细胞凋亡，发挥积极的防御功能：病毒感染细胞凋亡，阻止病毒复制阻止病毒复制二、细胞凋亡的过程二、细胞凋亡的过程 细胞凋亡的大致过程：细胞凋亡的大致过程：凋亡信号转导凋亡信号转导凋亡基因激活凋亡基因激活细胞凋亡的执行细胞凋亡的执行凋亡细胞的清除凋亡细胞的清除凋亡的四个阶段：凋亡的四个阶段： 凋亡诱导因素凋亡诱导因素+ 受体受体cAMPCa2+神经酰胺神经酰胺死亡信号死亡信号凋亡基因激活凋亡基因激活DNase激活激活Caspase激活激活巨噬细胞巨噬细胞吞噬分解吞噬分解凋亡细胞凋亡细胞凋亡过程凋亡过程受体受体cAMPCa2+神经酰胺神经酰胺凋亡相关凋亡相关基因激活基因激活信

7、信号号转转导导细胞膜细胞膜细胞核细胞核凋亡诱导因素凋亡诱导因素+DNase激活激活Caspases激活激活死亡信号死亡信号凋亡过程凋亡过程DNase激活激活Caspases激活激活凋亡细胞的凋亡细胞的清除清除凋亡执行凋亡执行三、凋亡时细胞的主要变化三、凋亡时细胞的主要变化（一）细胞凋亡的形态学改变 细胞凋亡的特征是细胞首先变圆,随即与邻周细胞脱离,失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,核染色质密度增高呈半月形,并凝聚在核膜周边,核仁裂解,进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个外有膜包裹、内涵物不外泄的凋亡小体，被吞噬细胞或邻周细胞所识别、吞噬,或自然脱落而离开生物。不引起炎症反应和

8、次级损伤。空泡化固缩出芽边集凋亡小体 形态学特征形态学特征染色质边集染色质边集 嗜酸性小体嗜酸性小体( (凋亡凋亡) )嗜酸性变及嗜酸性小体嗜酸性变及嗜酸性小体肝细胞体积缩小，胞浆浓缩红肝细胞体积缩小，胞浆浓缩红染，呈嗜酸性变；或胞浆进一染，呈嗜酸性变；或胞浆进一步浓缩，细胞变圆，核碎裂，步浓缩，细胞变圆，核碎裂，呈嗜酸性小体状呈嗜酸性小体状（二）细胞凋亡的生化改变（二）细胞凋亡的生化改变1. DNA片段化：形成片段化：形成180-200bp或整数倍的或整数倍的片段，在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的片段，在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的“梯状梯状”条带，是判断凋亡发生的客观指条带，是判断凋亡发生的

9、客观指标之一。标之一。凋亡后凋亡后DNA Ladder的的 agarose 电泳检测电泳检测2. 内源性核酸内切酶激活及其作用：内源性核酸内源性核酸内切酶激活及其作用：内源性核酸内切酶在核小体连接部切断内切酶在核小体连接部切断DNA双链。双链。 凋亡诱导因素凋亡诱导因素细胞内信号转导细胞内信号转导 无活性内源性核酸内切酶无活性内源性核酸内切酶 活性内源性核酸内切酶活性内源性核酸内切酶核小体连接部切断核小体连接部切断DNA双链双链电泳呈特征性的电泳呈特征性的“梯状梯状”条条带带Ca+Mg+激活Zn+抑制3. Caspase的激活及其作用的激活及其作用Caspase（含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶

10、）：（含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶）：一组对底物门冬氨酸部位有特异水解作用、其活性一组对底物门冬氨酸部位有特异水解作用、其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶，又称死亡蛋白酶中心富含半胱氨酸的蛋白酶，又称死亡蛋白酶主要作用：主要作用： 灭活细胞凋亡抑制物（灭活细胞凋亡抑制物（Bcl-2） 水解蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡小体水解蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡小体 水解级联反应相关活性蛋白，使之获得或丧失某水解级联反应相关活性蛋白，使之获得或丧失某种生物学功能种生物学功能 Caspase的作用的作用目前被鉴定的哺乳动物目前被鉴定的哺乳动物CaspaseCaspase 的特点1.含有高度保守的

11、QACXG(X为R、Q或G）五肽序列；2. 以半胱氨酸作为裂解底物的亲核基团；3. 以天门冬氨酸为特异性底物（羧基端肽键断裂）；4. 通常以无活性的酶原形式存在，须通过水解其氨基端一段序列激活；5. 活化后水解底物，通过级联放大诱发凋亡；6. 抑制剂，防止caspase酶原被偶然激活而对正常细胞造成伤害；3.Caspase触发凋亡途径 细胞外途径：细胞表面死亡受体途径 细胞内途径：线粒体引发途径 内质网介导的凋亡通路细胞外途径 细胞死亡信号蛋白结合细胞表面相应受体，死亡受体与配体结合，导致死亡结构域聚集，使死亡受体分子活化； Caspase-8活化：Caspase酶原在局部聚集，FADD与pr

12、ocaspase-8的DED结合形成信号复合物， procaspase-8水解活化形成有活性的caspase-8； 细胞凋亡： 激活的caspase-8激活下游的caspase引起细胞凋亡细胞内途径 是哺乳动物细胞程序性死亡的主要途径； 过程：凋亡刺激死亡促进因子，包括细胞色素C、凋亡诱导因子、促死亡蛋白、Caspase酶原释放Caspase活化细胞凋亡内质网介导的凋亡通路 内质网钙离子内环境紊乱及过量内质网蛋白积累激活Caspase-12； 同时胞质中的Caspase-7移入内质网，进一步激活 Caspase-12； 激活的Caspase-12可进一步剪切Caspase-3，细胞凋亡（三）细

13、胞凋亡的调控（三）细胞凋亡的调控1. 细胞凋亡的相关因素细胞凋亡的相关因素（1） 诱导性因素诱导性因素激素和生长因子失衡：缺乏（激素和生长因子失衡：缺乏（IL-2，淋巴细胞凋亡），淋巴细胞凋亡）或过多（糖皮质激素或过多（糖皮质激素，淋巴细胞凋亡），淋巴细胞凋亡） 理化因素：射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药理化因素：射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等物等 免疫性因素：如，免疫性因素：如，CTL分泌粒酶分泌粒酶靶细胞凋亡靶细胞凋亡微生物因素：细菌、病毒及毒素。（微生物因素：细菌、病毒及毒素。（HIV） （2 2）抑制性因素）抑制性因素 细胞因子：细胞因子：IL-2、神经营养因子、神经营养

14、因子 激素：激素：ACTH、睾丸酮、雌激素等、睾丸酮、雌激素等 二价金属阳离子：二价金属阳离子：Zn2+ 药物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑药物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、中性氨基酸制剂、中性氨基酸 病毒：病毒：EB病毒、牛痘病毒病毒、牛痘病毒CrmA2. 细胞凋亡信号转导细胞凋亡信号转导 凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片片段化及细胞结构蛋白降解的中间环节。段化及细胞结构蛋白降解的中间环节。凋亡信号转导系统的特点：凋亡信号转导系统的特点：多样性：不同种类细胞有不同系统多样性：不同种类细胞有不同系统耦联性：凋亡与增殖分化系统在某些环节耦联，

15、耦联性：凋亡与增殖分化系统在某些环节耦联，同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统多途性：同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统多途性：同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统研究较多的系统：研究较多的系统：依据：依据：细胞凋亡时胞内游离细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升浓度显著上升用用Ca2+载体载体A23187人为升高人为升高B淋巴细胞淋巴细胞Ca2+水平，水平，B淋巴细胞凋亡淋巴细胞凋亡用用Ca2+络合剂降低胞内络合剂降低胞内Ca2+水平，阻止细胞凋亡水平，阻止细胞凋亡

16、激活激活Ca2+依赖谷氨酰胺转移酶依赖谷氨酰胺转移酶Ca2+ 活化核转录因子活化核转录因子1胞内胞内Ca2+信号系统（信号系统（Ca2+为第二信使）为第二信使）2cAMP/PKA信号系统（信号系统（cAMP为第二信使）为第二信使）依据：依据：双丁酰双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡凋亡糖皮质激素使糖皮质激素使cAMP上升上升cAMP激活激活PKA使靶蛋白某些氨基酸（苏、丝使靶蛋白某些氨基酸（苏、丝AA）残基磷酸化残基磷酸化改变蛋白质功能改变蛋白质功能3Fas蛋白蛋白/Fas配体信号系统配体信号系统Fas蛋白：细胞膜跨膜蛋白蛋白：细胞膜跨膜

17、蛋白Fas蛋白蛋白+Fas配体（抗配体（抗Fas）细胞凋亡细胞凋亡机制：机制：Fas蛋白蛋白+Fas配体（抗配体（抗Fas）神经鞘磷脂酶活性神经鞘磷脂酶活性产生神经酰胺产生神经酰胺蛋白激酶激活蛋白激酶激活细胞凋亡细胞凋亡Fas蛋白蛋白+抗抗Fas、TNF 激活激活ICE样样caspase 降解降解H1组蛋白组蛋白染色体松驰染色体松驰DNA暴露内切酶位点暴露内切酶位点通过通过Ca2+信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡4神经酰胺信号系统神经酰胺信号系统神经酰胺：神经鞘磷脂（神经酰胺：神经鞘磷脂（SM）在神经鞘磷脂酶的）在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类新型第二信使物质。

18、作用下产生的一类新型第二信使物质。介导细胞凋亡的依据：用天然神经酰胺处理介导细胞凋亡的依据：用天然神经酰胺处理u937白血病细胞，诱导细胞凋亡白血病细胞，诱导细胞凋亡神经酰胺途径相关诱因：电离辐射、神经酰胺途径相关诱因：电离辐射、TNF-、Fas抗原、糖皮质激素抗原、糖皮质激素 5二酰甘油二酰甘油/蛋白激酶蛋白激酶C（PKC）信号系统）信号系统二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催催化下产生的一种第二信使物质。化下产生的一种第二信使物质。依据：依据：活化的活化的PKC1可诱导可诱导u937白血病细胞凋亡白血病细胞凋亡抑制抑制PKC活性可抑制糖皮质激

19、素诱导的小鼠胸腺活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞凋亡细胞凋亡PKC激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡（糖激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡（糖皮质激素、皮质激素、T细胞受体激活、细胞受体激活、IL-2撤除）撤除）6酪氨酸蛋白激酶系统酪氨酸蛋白激酶系统生长因子或细胞因子生长因子或细胞因子激活酪氨酸蛋白激酶激活酪氨酸蛋白激酶靶蛋白酪靶蛋白酪氨酸磷酸化氨酸磷酸化Ras蛋白激活蛋白激活通过通过Raf-1、MAPKK、MAPK蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化细胞分化细胞分化生长因子或细胞因子撤除生长因子或细胞因子撤除不能激活酪氨酸蛋白激酶系不能激活酪氨酸蛋白激酶系统统细胞凋亡细胞凋亡3. 3. 凋亡相关基

20、因凋亡相关基因抑制凋亡基因：抑制凋亡基因：Bcl-2促进凋亡基因：促进凋亡基因：P53、Bax、ICE双向调节基因：双向调节基因：c-myc、Bclx(B细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤/白血病白血病-2B cell lymphoma / leukemia-2基因的基因的缩写缩写) Bcl-2蛋白：蛋白：229个氨基酸（人）、个氨基酸（人）、236个氨基酸（小鼠）个氨基酸（小鼠）分布：线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜分布：线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜作用：作用：Bcl-2高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡依据：依据：导入导入Bcl-2基因质

21、粒可防止神经细胞因撤除神经生长因子所诱基因质粒可防止神经细胞因撤除神经生长因子所诱导的凋亡导的凋亡淋巴细胞有淋巴细胞有20%呈呈Bcl-2阳性时，预后不佳（耐受放射线、阳性时，预后不佳（耐受放射线、抗癌药物）抗癌药物）（1）Bcl-2 直接的抗氧化作用直接的抗氧化作用 抑制线粒体释放促凋亡蛋白质（细胞色素抑制线粒体释放促凋亡蛋白质（细胞色素C、AIF） 抑制促凋亡调节蛋白抑制促凋亡调节蛋白Bax、Bak的细胞毒作用的细胞毒作用 抑制凋亡蛋白酶（抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活）的激活 维持细胞钙稳态维持细胞钙稳态Bcl-2抗凋亡作用机制：抗凋亡作用机制：作用：作用：野生型（野生型（wt

22、P53）：）：DNA结合蛋白，诱导细胞凋亡结合蛋白，诱导细胞凋亡（“分子警察分子警察”）突变型突变型（mtP53） ：抑制细胞凋亡：抑制细胞凋亡野生型野生型P53的作用机制：的作用机制：P53蛋白蛋白细胞周期细胞周期G1期检查染期检查染色体色体DNA损伤（检查点功能）损伤（检查点功能）发现发现DNA损伤损伤剌激剌激CIP的表达的表达阻止细胞进入下一周期，启动阻止细胞进入下一周期，启动DNA修复机制修复机制修修复失败复失败启动细胞凋亡机制启动细胞凋亡机制细胞凋亡细胞凋亡（2）P53c-myc: 一种癌基因，它能诱导增殖，也能诱导细胞凋亡，具有双向一种癌基因，它能诱导增殖，也能诱导细胞凋亡，具有双

23、向调节作用。调节作用。作用机制：作用机制：c-myc蛋白为重要的转录调节因子，既可介导细蛋白为重要的转录调节因子，既可介导细胞增殖，也可激活介导细胞凋亡，其作用取决于细胞接受何胞增殖，也可激活介导细胞凋亡，其作用取决于细胞接受何种信号及细胞的生长环境（有生长因子种信号及细胞的生长环境（有生长因子增殖，无生长因子增殖，无生长因子凋亡）。凋亡）。Bcl-x：能翻译：能翻译Bcl-XL和和Bcl-Xs两种蛋白，两种蛋白，Bcl-XL蛋白抑蛋白抑制细胞凋亡，制细胞凋亡，Bcl-Xs蛋白促进细胞凋亡蛋白促进细胞凋亡（3）c-myc, Bcl-x三、三、 细胞凋亡的发生机制细胞凋亡的发生机制1、氧化损伤、

24、氧化损伤氧化损伤的后果之一：细胞凋亡氧化损伤的后果之一：细胞凋亡依据：依据：各种氧化剂（各种氧化剂（H2O2）可直接诱导细胞凋亡）可直接诱导细胞凋亡抑制超氧化物歧化酶（抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性可诱导细胞凋亡）活性可诱导细胞凋亡抗氧化剂（抗氧化剂（VitE、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素（背景的各种凋亡诱导因素（TNF-、电离辐射）引起、电离辐射）引起的细胞凋亡的细胞凋亡引起引起DNA损伤，激活损伤，激活P53基因基因引起引起DNA损伤，活化多聚损伤，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭辅酶核糖合成酶，耗竭辅酶(NAD)，消耗大量，消耗大量AT

25、P攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化，细胞膜损伤或产攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化，细胞膜损伤或产生过氧羟基生过氧羟基24碳四烯酸碳四烯酸激活激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶依赖的核酸内切酶细胞膜损伤，细胞膜损伤，Ca2+内流增多及损伤线粒体，通透性增加膜内流增多及损伤线粒体，通透性增加膜电位改变电位改变活化核转录因子活化核转录因子NF-B、AP-1，加速凋亡相关基因表达，加速凋亡相关基因表达氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：2.钙稳态失衡钙稳态失衡细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一依据：依据：各种凋亡刺激所引

26、起的凋亡是钙依赖过程各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程凋亡发生时胞浆凋亡发生时胞浆Ca2+浓度显著上升，并在随后的一系列浓度显著上升，并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用（核酸内切酶激活、需钙蛋白酶、凋亡改变中起关键性作用（核酸内切酶激活、需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的空泡化）磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的空泡化）钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（神经退行性疾钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（神经退行性疾病）病）激活激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解依赖的核酸内切酶，降解DNA链链激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽链激活谷氨酰胺转移

27、酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成利于凋亡小体形成激活核转录因子，加速凋亡相关基因表达激活核转录因子，加速凋亡相关基因表达Ca2+在在ATP的配合下使的配合下使DNA链舒展，暴露核小体之间的链舒展，暴露核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于连接区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割内切酶切割DNA钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：3、线粒体损伤、线粒体损伤线粒体的改变：线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜跨膜线粒体的改变：线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜

28、跨膜电位（电位（m）下降，能量代谢水平显著降低）下降，能量代谢水平显著降低线粒体改变在细胞凋亡发生中起关键作用线粒体改变在细胞凋亡发生中起关键作用依据：依据：抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡在细胞核出现凋亡改变之前，常先有线粒体内膜跨膜电在细胞核出现凋亡改变之前，常先有线粒体内膜跨膜电位（位（m）下降）下降阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡（阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡（Bcl-2）四、四、 细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病（一）细胞凋亡不足（一）细胞凋亡不足1. 肿瘤肿瘤 发生机制：细胞增殖过度是肿瘤发病的一个途径，凋

29、发生机制：细胞增殖过度是肿瘤发病的一个途径，凋亡受抑、细胞死亡不足是肿瘤发病的另一途径，结果导致亡受抑、细胞死亡不足是肿瘤发病的另一途径，结果导致病变组织内肿瘤细胞存活延长，存活大于死亡，肿瘤细胞病变组织内肿瘤细胞存活延长，存活大于死亡，肿瘤细胞数目净增长加大，形成新生物。数目净增长加大，形成新生物。凋亡受抑的依据：凋亡受抑的依据：多种肿瘤组织中多种肿瘤组织中Bcl-2表达显著高于周围组织表达显著高于周围组织许多肿瘤许多肿瘤P53发生突变，突变型发生突变，突变型P53抑制细胞凋亡抑制细胞凋亡发生机制：从细胞凋亡角度看，自身免疫病发生机制：从细胞凋亡角度看，自身免疫病的发病是由于细胞凋亡不足，未

30、能有效清除的发病是由于细胞凋亡不足，未能有效清除自身免疫性自身免疫性T细胞所致。细胞所致。依据：糖皮质激素能诱导淋巴细胞凋亡，为依据：糖皮质激素能诱导淋巴细胞凋亡，为治疗自身免疫病的有效药物之一。治疗自身免疫病的有效药物之一。2.2.自身免疫病自身免疫病（二）细胞凋亡过度（二）细胞凋亡过度1.1.心血管疾病心血管疾病（1 1）心肌缺血与心肌缺血）心肌缺血与心肌缺血- -再灌注损伤再灌注损伤 心肌缺血与心肌缺血心肌缺血与心肌缺血- -再灌注损伤造成的心肌细胞再灌注损伤造成的心肌细胞损伤不但有坏死，也有细胞凋亡（干预靶点）。损伤不但有坏死，也有细胞凋亡（干预靶点）。特点：特点：缺血早期以细胞凋亡为

31、主，晚期以细胞坏死为主缺血早期以细胞凋亡为主，晚期以细胞坏死为主梗死灶中央通常以坏死为主，周边以细胞凋亡为主梗死灶中央通常以坏死为主，周边以细胞凋亡为主轻度缺血以细胞凋亡为主，重度缺血通常以坏死为主轻度缺血以细胞凋亡为主，重度缺血通常以坏死为主急性、严重的心肌缺血以坏死为主，慢性、轻急性、严重的心肌缺血以坏死为主，慢性、轻度的心肌缺血以细胞凋亡为主度的心肌缺血以细胞凋亡为主细胞凋亡的机制：细胞凋亡的机制：氧化应激有关（氧化应激有关（SOD可减少细胞凋亡）可减少细胞凋亡）Fas上调通过与上调通过与FasL反应导致细胞凋亡反应导致细胞凋亡与与P53基因激活有关（缺氧可增加基因激活有关（缺氧可增加P

32、53基因的基因的转录）转录） 心肌细胞凋亡造成心肌细胞数量减少可能是心心肌细胞凋亡造成心肌细胞数量减少可能是心力衰竭发生发展的原因之一。力衰竭发生发展的原因之一。在压力负荷过重引起的心力衰竭动物模型上观察到在压力负荷过重引起的心力衰竭动物模型上观察到左室心肌肥大的同时，心肌细胞数量减少，经分析是左室心肌肥大的同时，心肌细胞数量减少，经分析是由细胞凋亡造成由细胞凋亡造成心衰病人心肌标本，心肌凋亡指数高达心衰病人心肌标本，心肌凋亡指数高达35.5%，对，对照组为照组为0.2-0.4%诱因：氧化应激、压力或容量负荷过重、神经诱因：氧化应激、压力或容量负荷过重、神经-内分内分泌失调、细胞因子、缺血缺氧

33、。泌失调、细胞因子、缺血缺氧。（2 2）心力衰竭）心力衰竭 在神经系统疾病中有一类以特定神经元进行性在神经系统疾病中有一类以特定神经元进行性丧失为其病理特征的疾病：阿尔茨海默氏病（丧失为其病理特征的疾病：阿尔茨海默氏病（AD），），帕金森氏病，多发性硬化症帕金森氏病，多发性硬化症举例：阿尔茨海默氏病（举例：阿尔茨海默氏病（AD）与细胞凋亡的关系：）与细胞凋亡的关系：AD患者的尸检发现，海马及基底神经核的胆碱能神患者的尸检发现，海马及基底神经核的胆碱能神经元丧失达经元丧失达30-50%，有时高达，有时高达90%，大脑皮质也有，大脑皮质也有不同程度的神经元丧失，大脑皮质出现广泛萎缩，脑不同程度的神

34、经元丧失，大脑皮质出现广泛萎缩，脑沟变宽，脑回变窄，脑室扩大。沟变宽，脑回变窄，脑室扩大。2. 2. 神经元退行性疾病神经元退行性疾病诱因：诱因：-淀粉样蛋白、钙超载、氧化应激、神经淀粉样蛋白、钙超载、氧化应激、神经生长因子分泌不足生长因子分泌不足可能机制：可能机制：致病因素（如：氧自由基）致病因素（如：氧自由基）神经元神经元Ca2+内流内流-淀粉样蛋白合成相关基因激活淀粉样蛋白合成相关基因激活-淀粉样蛋淀粉样蛋白白神经细胞凋亡神经细胞凋亡发病机制：发病机制：HIV感染感染CD4+淋巴细胞淋巴细胞CD4+淋巴淋巴细胞显著细胞显著免疫功能缺陷免疫功能缺陷细胞凋亡相关因素：细胞凋亡相关因素：gp1

35、20糖蛋白：糖蛋白：gp120糖蛋白糖蛋白+受体受体细胞凋亡细胞凋亡合胞体形成：合胞体形成：HIV感染感染合胞体形成合胞体形成细胞凋亡细胞凋亡Fas基因表达上调：基因表达上调：HIV感染感染Fas基因表达上调基因表达上调Fas+ FasL细胞凋亡细胞凋亡3. 病毒感染病毒感染_获得性人类免疫缺陷病（获得性人类免疫缺陷病（AIDS）T细胞激活：细胞激活：HIV感染感染CD4+细胞激活细胞激活生长生长因子缺乏因子缺乏细胞凋亡细胞凋亡细胞因子：细胞因子：HIV感染感染TNFTNF + TNFR-1细胞凋亡细胞凋亡tat蛋白：蛋白：HIV感染感染产生产生tat蛋白蛋白CD4+淋巴细淋巴细胞胞诱导产生氧

36、自由基和诱导产生氧自由基和Fas基因表达上调基因表达上调Fas+ FasL细胞凋亡细胞凋亡HIV慢性感染慢性感染CD4+（HIV-）淋巴细胞攻击）淋巴细胞攻击CD4+（HIV+）淋巴细胞）淋巴细胞细胞凋亡细胞凋亡动脉粥样硬化：内皮凋亡过度，平滑肌细胞凋亡不足动脉粥样硬化：内皮凋亡过度，平滑肌细胞凋亡不足依据：依据：内皮细胞凋亡过度：内皮细胞凋亡过度：LDL升高、血小板激活、升高、血小板激活、Ag、高血压可引起内皮细、高血压可引起内皮细胞凋亡胞凋亡检测粥样硬化的冠状动脉，病变部位内皮细胞凋亡达检测粥样硬化的冠状动脉，病变部位内皮细胞凋亡达34%，远高于对照，远高于对照8%平滑肌细胞凋亡不足：平滑

37、肌细胞凋亡增多，但仅为增平滑肌细胞凋亡不足：平滑肌细胞凋亡增多，但仅为增殖细胞的殖细胞的75%，细胞凋亡相对不足。，细胞凋亡相对不足。（三）细胞凋亡不足与过度并存（三）细胞凋亡不足与过度并存五、细胞凋亡检测五、细胞凋亡检测 形态学观察方法 DNA凝胶电泳 酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 流式细胞仪定量分析 Western blot检测（一）形态学观察方法（一）形态学观察方法 HE染色：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象2.丫啶橙（AO) 染色 AO透过胞膜完整的细胞，崁入细胞核DNA，发绿色荧光； 活细胞核呈绿色荧光； 凋亡细胞染色增强，核染色质

38、呈黄绿色或橘红色，浓聚在核膜内侧（核固缩），可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体； 坏死细胞：核染色质橘红色3. 台盼蓝染色 如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死细胞。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞； 区分坏死细胞4. 透射电镜观察透射电镜观察 可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体及凋亡小体被临近吞噬细胞吞噬现象。（二）（二）DNA凝胶电泳凝胶电泳 检测原理：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质内出现DN

39、A片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180200bpDNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 结果判断 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。 （三）酶联免疫吸附法（三）酶联免疫吸附法（ELISA)核核小体测定小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤检测步骤 将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 在微定量板上吸附组蛋白体； 加上清液使抗组蛋白抗体

40、与核小体上的组蛋白结合； 加辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合； 加酶的底物，测光吸收值。 特点 该法敏感性高； 应用广泛； 操作简单； 不能精确定量（四）流式细胞仪定量分析（四）流式细胞仪定量分析 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。 1. PI单染色法单染色法2. TUNEL 法 即原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique, ISEL)； 原理：利用TdT（末端DN

41、A转移酶）将标记的dUPT连接到3-OH端形成新的DNA； 特点：敏感度高，操作简单，应用广泛； 也可以进行形态学观察 3. PI-Annexin V双标法双标法 原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测； 磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，与PS具有高度的结合力； 将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞染色。结果判断 正常活细胞Annexin V 、PI均低染； 凋亡细胞Annexin V高染、PI低染； 坏死细胞Annex

42、in V/PI均高染。 应用应用 细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡； 较TUNEL法更为灵敏； 不需固定细胞； 是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。 4. Hoechst 33342/PI双染色法双染色法 Hoechst和PI均可以与细胞核DNA或RNA结合，但PI不能通过正常的细胞膜，而Hoechst为膜通透性荧光染料，正常细胞、坏死细胞、凋亡细胞均着色； 正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），细胞形态正常；凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），核碎片状，边集；坏死细胞为

43、低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI+） （五）其它检测方法（五）其它检测方法 Caspase-3活性的检测活性的检测 1. Caspase-3活性的检测活性的检测 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。 Wester

44、n blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。 荧光分光光度计分析 原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物 ）。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。 细胞凋亡

45、细胞凋亡（科普诗）（科普诗）似秋叶的凋零，似秋叶的凋零，告别生命之辉煌；告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命的末端；逼细胞步步走向生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡线粒体把生命之光一点一点拧淡; 危难中的细胞啊，危难中的细胞啊， 你沉稳不乱，你沉稳不乱， DNA片片切割，片片切割， 化云梯直通天堂；化云梯直通天堂； 细胞体分团相聚，细胞体分团相聚， 把生命的凝重浓集在小体上；把生命的凝重浓集在小体上； 分别了朝夕相处的伙伴，分别了朝夕相处的伙伴， 再见了快乐美好的时光；再见了快乐美好的时光； 这一切的一切又融入临近的胞体，这一切的一切又融入临近的胞体， 腾出的空间再写生命的篇章。腾出的空间再写生命的篇章。