第二章基因工程的酶学.ppt
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1、Review 模板序列 第二章基因工程的酶学基础 Enzymes II类 限制性内切酶 限制性内切酶的存在给没给基因工程操作带来麻烦 限制性内切酶在基因工程操作中有哪些具体用途 首先由H O Smith和K W Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来 II类 限制性内切酶 分离的第一个酶是Hind 一 限制性内切酶的基本特性 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列 并由此处切割DNA双链的核酸内切酶 1 识别位点 4 8bp 回文结构 思考题1 在序列5 CGAACATATGGAGT 3 中含有一个6bp的II类限制性内切核酸酶的识别序列 该位点的序列可能是什么 2 下面几
2、种序列中你认为哪一个 哪些 最有可能是II类限制性内切核酸酶的识别序列 GAATCG AAATTT GATATC ACGGCA 为什么 2 内切酶与识别序列的结合模式 1986年J A McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合 3 切割位点 识别位点处 4 粘性末端 stickyends cohensiveends 含有几个核苷酸单链的末端 CTGCA G 3 端凸出 如PstI切点 G ACGTC 5 3 3 5 5 3 3 5 CTGCAG GACGTC 连接便利 5 粘性末端的意义 只要粘性末端碱基互补就可以连接 这比连接两个平齐末端容易的多
3、凸出的3 端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴 如AAA或TTT等 造成人工粘性末端 5 末端标记 3 末端加尾 凸出的5 末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记 识别位点的序列相同的限制性内切酶 6 同裂酶 Isoschizomers 识别位点相同 但切点不同 如XmaI和SmaI 不完全同裂酶 识别的序列不同 但能切出相同的粘性末端 如BamHI Bgl BclI Xho 等 7 同尾酶 Isocaudamers 5 GATC 3 3 CTAG 5 Sau3A 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别 5 G3 CCTAG GATCT 3 A 5 BamHI
4、 Bgl 5 GGATCT 3 3 CCTAGA 5 BamHI Bgl Sau3A 二 DNA末端长度对限制酶切割的影响 限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求 也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸 否则限制酶将难以发挥切割活性 在设计PCR引物时 如果要在末端引入一个酶切位点 为保证能够顺利切割扩增的PCR产物 应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目 另外 了解末端长度对切割的影响还可帮助在双酶切多克隆位点时选择酶切秩序 温馨提示 Becareful 表1 靠近DNA片段末端的切割效率 用寡核苷酸检测 某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割 即对不
5、同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱 三 位点偏爱 Sitepreference 噬菌体DNA为48502bp 含12bp粘端 EcoR 酶切割 噬菌体中的5个位点时并不是随机的 靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍 某些噬菌体DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性是不同的 如 四 在实验室条件下进行酶切 20微升反应体系 五 酶切反应条件 终止酶切的方法 缓冲液 Buffer 1 缓冲液的化学组成 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同 大多数是37oC 少数要求40 65oC 温度 EcoR 若反应16小时 所需酶量为正常酶切时间的1 8 即若反应时间为16小
6、时 则所用酶量为只切1小时的1 8 反应时间 反应时间通常为1小时或更多 许多酶延长反应时间可减少酶的用量 例如 终止酶切的方法 苯酚 与酶切反应条件相关的两个现象 在极端非标准条件下 限制酶能切割与识别序列相似的序列 这个改变的特殊性称 星号 活性 1 星号 活性 EcoRI和BamHI等都有 活性 在低盐 高pH 8 时可识别和切割 GAATTA AAATTC GAGTTC等 GAATTC EcoRI 使用的时候要特别注意 内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开 2 完全消化与局部消化 1 2 3 4 1 2 3 4 1 完全消化 只有有限数量的酶切位点被切开 通过缩短保温时间 降低反应温
7、度或减少酶的用量可达到局部消化的目的 2 局部消化 1 2 3 4 1 4 请确定XbaI XhoI和KpnI位点在DNA上的相对位置 六 影响限制性内切酶活性的因素 从细菌DNA环化现象推测 必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶 第二节DNA连接酶 一 DNA连接酶 ligase 的发现 DNA复制一定有断口 1 大肠杆菌连接酶 1 两种DNA连接酶 只能连接粘性末端 二 DNAligase的特点 2 T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端 还能连接齐平末端 1 必须是两条双链DNA 2 DNA3 端有游离的 OH 5 端有一个磷酸基团 P 3 需要能量 动物或噬菌体中 ATP大肠杆
8、菌中 NAD 2 连接条件 1 ATP NAD 提供激活的AMP 三 连接反应的机理 2 ATP与连接酶形成共价 连接酶 AMP 复合物 并释放出焦磷酸PPi 3 AMP与连接酶的赖氨酸 氨基相连 OC C CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 H3N AMP ATP PPi 4 AMP随后从连接酶的赖氨酸 氨基转移到DNA一条链的5 端P上 形成 DNA 腺苷酸 复合物 OH HO P AMP OH O P AMP 5 3 OH对磷原子作亲核攻击 形成磷酸二脂键 释放出AMP 连接酶反应的最佳温度是37 C 四 连接反应的温度 1 最佳温度 但在37 下粘性末端的结合很不稳定 2 实用温度
9、 所以一般采用4 16 C 增加插入片段与载体的接触机会 减少载体自我连接的现象 1 插入片段与载体的浓度比例 2 反应温度 12 5 五 影响连接反应的因素 10 20倍 一般14 16 第三节DNA聚合酶 自学 一 基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶2 Klenowfragment3 T7DNA聚合酶4 T4DNA聚合酶5 修饰过的T7DNA聚合酶6 逆转录酶 1 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3 OH端 2 主要区别 T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来 二 常用的D
10、NA聚合酶的特点 持续合成能力和外切酶活性不同 3 常用DNA聚合酶的特性比较 三 DNA聚合酶在基因工程中的用途 1 大肠杆菌DNA聚合酶I 主要用来制备带放射性标记的DNA探针 1 大肠杆菌DNA聚合酶I的性质 一条单链多肽 5 3 外切酶活性位于N端 用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5 3 外切酶活性部分 就成为Klenowfragment 底物 dNTPs dATP dGTP dCTP dTTP Mg2 带有3 OH游离端的引物 DNA模板 2 DNA聚合酶I PolI 的反应条件 OH 5 3 dNTPs 标记 核酸探针 probe 能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的 带有标记
11、的寡聚核酸分子 3 用DNA聚合酶I制备探针 已知序列的核酸片断 显示位置 与互补的待测序列杂交 标记 已知序列的核酸片断 探针的标记方式 标记 已知序列的核酸片断 带有放射性的已知序列的核酸片断 5 3 DNA聚合酶I对探针序列的标记 缺口转移法 nicktranslation 放射性同位素标记 DNA聚合酶I同时具备5 3 外切酶活性和5 3 的聚合酶活性 以及3 5 外切酶活性 5 3 外切酶活性从DNA缺口的下一段DNA5 端除去一个核苷酸后 聚合酶活性就会在缺口的上一段DNA的3 一侧补上一个新的核苷酸 缺口 缺口 5 5 3 3 5 3 5 3 纯化的DNA片断 DNaseI制造单
12、链缺口 DNAPolI进行缺口转移 一种 32P dNTP和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 32P dNTP 32P dNTP 从头至尾都被标记 8 2 Klenowfragment 具有5 3 聚合酶活性和3 5 外切酶活性 失去了5 3 外切酶活性 1 Klenowfragment的性质 DNAPolI Klenowfragment 76KD 枯草杆菌蛋白酶 3 端补平 5 5 klenow DNA3 末端标记 补平限制性内切酶切后形成的3 隐蔽端 在3 隐蔽端加上放射性标记的dNTP klenow 2 主要用途 3 隐蔽末端的DNA片断 Kle
13、nowfragment补平 根据末端的顺序选择一种 32P dNTPs 末端标记的DNA 限制性内切酶切 5 G3 3 CTTAA5 5 GAA3 3 CTTAA5 5 GAATT3 3 CTTAA5 5 G3 3 CCTAG5 5 GG3 3 CCTAG5 5 GGATC3 3 CCTAG5 EcoRI BamHI 32P dATP 32P dGTP 25oC1h cDNA第二链的合成 mRNA cDNA第一链 逆转录 cDNA第二链 klenow 5 3 3 5 5 3 引物 1 T4DNA聚合酶的性质 3 T4DNA聚合酶 从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化 由噬菌体基因43编
14、码 有5 3 聚合酶活性和3 5 外切酶活性 降解单链更快 来源 酶活性 特点 当没有dNTP时 T4DNA聚合酶行使3 5 外切酶功能 制造出3 隐蔽端 如果只有一种dNTP 则降解到该dNTP的位置 5 5 3 3 5 5 3 3 T4DNA聚合酶 无dNTPs T4DNA聚合酶 有dNTPs 5 5 2 T4DNA聚合酶的用途 标记末端 取代合成法 用3 5 外切酶活性作用于所有末端形式的3 端 平端 3 隐蔽端 5 隐蔽端 制造出3 隐蔽端 再利用它的5 3 聚合酶活性补平 并加入放射性标记的dNTP 补平隐蔽末端 DNA3 末端标记 酶切中间产生两个末端标记 加入某种32P dNTP



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