青岛科技大学海洋生物技术期末复习.docx
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1、基因工程1. 基因是能够表达和产生基因产物(蛋白质或RNA)的DNA序列。 分类:根据产物的类别可以分为蛋白质基因和RNA基因(rRNA基因和tRNA基因)两大类; 根据产物的功能可以分为结构基因(酶和不直接影响其他基因表达的蛋白质)和调节基因(阻遏蛋白或转录激活因子)两大类。2.基因工程或称基因重组技术,是将不同生物的基因在体外人工剪切、组合,并和载体(质粒,噬菌体,病毒)DNA连接,然后转入微生物或细胞内,进行扩增,并使转入的基因在细胞内表达,产生所需要的蛋白质。3.基因工程的操作包含以下步骤: 获得目的基因 构造重组 DNA 分子转化或转染表达 蛋白质产物的分离纯化 4.克隆(clone
2、):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。5.克隆化(cloning)包括:1.获取同一拷贝的过程,即无性繁殖。2.分子克隆(DNA克隆)3. 细胞克隆个体克隆(动物或植物)6.DNA克隆:应用酶学的方法,在体外将各种来源 的DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子,继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子,又称基因 克隆。7.工具酶:限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 DNA连接酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶(1)限制性核酸内切酶定义:识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内酶。是细菌内存
3、在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。粘性末端:5-端突出,3-端突出 平末端:限制性核酸内切酶识别序列长度为48个bp。不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端(compatible end),可用连接酶连接。目的基因:应用重组DNA技术所要分离、获得的基因。1. cDNA是指经反转录合成的,与RNA互补的单链DNA。以单链 cDNA为模板,经聚合反应可合成双链cDNA。2. 基因组DNA是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。3.基因载体(vector):能携带目的基因,实现无性繁殖所采用的可独立复制的完整DNA分子。又称克隆载体。其中为表达出蛋
4、白质设计的载体又称表达载体。4.常用的载体:质粒、噬菌体DNA、病毒DNA5.载体的选择标准:能自主复制;具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选和鉴定;有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点;分子相对较小,一般3-10 Kb6.质粒:是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1 3个抗药性基因,以利于筛选。重组DNA技术基本原理原理部分目的基因的获取1.化学合成法:用于已知序列,或可推导出序列的基因2.基因组DNA:基因组DNA文库(genomic DNA library)3.cDNA:cDNA文库4.聚合酶链反应PCR8.基因组
5、DNA文库:存在于转化细菌内,由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。简称G文库。9.cDNA文库用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后,建立的基因文库。简称c文库。10. PCR的基本原理原料:4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+反应过程:高温变性、低温退火、适温延伸。11.克隆载体的选择构建目的(构建gDNA或cDNA文库类型、和表达、亚克隆等不同目的)选择对应的载体;考虑载体中酶切位点是否合适;根据待克隆的目的基因片段的大小选择合适的载体。(三)外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接2. 平端连接:限制性内切酶作用产生的平端;粘端经特殊酶处理变为平端3.
6、 同聚物加尾连接:由末端转移酶作用,在DNA片段末端加上同聚物序列,制造出粘性末端再连接。4. 人工接头:由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸,再用限制酶切产生粘性末端,进行连接。(四)重组DNA导入受体菌受体菌条件:安全宿主菌、处于感受态导入方式:转化(transformation)转染(transfaction) 若受体细胞是细菌,通常称转化;若受体细胞是 动/植物细胞,通常称转染。(五)重组体的筛选:重组DNA导入受体菌后,经过培养使其大量繁殖,再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来,这一过程即为筛选(screening)或选择(selection)。1. 直接选择法针对载体携带某种或某
7、些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。其特点是直接测定基因或基因表型。(1)抗药性标记选择(插入失活法):将目的基因插入带ampr和tetr基因载体的tetr基因中,则tetr基因失活。在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养,进行筛选。(2)标志补救(marker rescue) 若目的基因能够在宿主菌表达,且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补,就可利用对营养素的依赖表型来筛选。 (3)分子杂交法:利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交,直接选择并鉴定目的基因。两种方法:原位杂交,Southern印迹 (4)酶切鉴定(5)菌落PCR (6)
8、序列分析(六)克隆基因的表达 表达体系的建立:表达载体的构建受体细胞的建立 表达产物的检测表达产物的分离、纯化复习思考题:1. 概念:(1)克隆(2)转化(3)基因工程(4)限制性核酸内切酶(5)载体(6)G文库(7)质粒(8)c文库2. 简述基因工程的基本过程。3. 简述目的基因的主要来源或途径。参考答案:(1)人工合成(2)cDNA (3)G-DNA (4)PCR 4. 已知某一基因的DNA单链 5ATGGGCTACTCG3 (1)写出DNA复制时另一条单链的核苷酸序列。 (2) 以该链为模板转录成RNA序列。(3)合成的多肽序列。 参考密码子: UAC 酪氨酸 CCG脯氨酸 CGA精氨酸
9、 CAU组氨酸 AUG蛋氨酸 AGC丝氨酸 GUA缬氨酸 GCC丙氨酸 答案:5ATGGGCTACTCG3 DNA (1) 3TACCCGATGAGC5 DNA (2) 3UACCCGAUGAGC5 mRNA (3) 5CGA GUA GCC CAU3 N ArgVal Ala His C 多肽链5. 在基因工程中,为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物,为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子? 提示 关键点:真核生物有内含子 6. 某一质粒基因载体具有Tet抗性和Kan抗性的表型,在Kan抗性基因内有一Bgl ll的切点。先用Bgl ll切割该载体进行
10、基因克隆,问(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型? 7.怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR限制位点中去?8.如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码蛋白的基因,并使之在大肠杆菌中进行表达?简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。9.说明合成接头在基因工程中的主要作用动物基因工程1.转基因动物:用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内,并能稳定传代的一类动物。特点:分子及细胞水平操作,组织及动物整体水平表达。基本原理将目的基因导入实验动物的受精卵或着床前胚胎细胞中,使目的基因整合到基因组中,然后将此受精卵或胚胎细胞移植入受体动物的输卵管
11、或子宫内,使其发育成携带有目的基因的转基因动物。制作转基因动物的主要方法n DNA显微注射法n 电脉冲导入法n 精子载体法n 逆转录病毒感染法1.显微注射法是基因转移中应用最广泛和最成功的方法之一。 显微注射法是在显微注射仪上,一侧用吸管固定受精卵,另一侧将注射针插入受精卵原核。拔出显微注射针解除固定管的负压,操作完成。优点:将外源DNA片段直接注入受精卵原核,使外源DNA随机整合到寄主基因组中,整合效率高,并且多数基因能够表达。缺点:受生物种类的影响;操作复杂,工作效率低。2.电脉冲导入法3.精子载体法定义:将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育,使精子携带外源DNA,受精后外源DNA整合至
12、染色体中。精子作为外源基因的转移载体依赖于将外源基因先“装载”到精子细胞中。常用的装载方法有:脂质体介导促进精子对外源基因的吸收;电脉冲介导促进精子对外源基因的吸收;精子结合外源 DNA的机制 用精子载体法成功的获得转基因动物,精子与外源DNA共孵育期问有3个关键步骤: 与精子的结合内化入精子头部在精子基因组中的整合精子结合外源 DNA的定位及去向 定位:主要位于精子头部的赤道段和顶体后区,而且主要吸附于精子头部表面,少数侵入到精子核区。 去向:穿入精子核区的外源DNA首先紧密结合在核骨架上,随后与精子细胞基因组发生重组,且重组不是随机发生,精子细胞基因组上可能存在某些优先选择的重组位点。影响
13、精子与外源 DNA结合及结合后基因转移的因素 n较长的DNA片段与较短的DNA片段相比更容易被精子摄取n脱氧核糖核酸酶对外源DNA有降解 n较高浓度的DNA易引起胚胎的死亡n精子来源不同生殖细胞的精子由于可跟卵子形成受精卵,将它制作为外源基因转移载体来制备转基因动物,具有操作简单、耗费低、转染率高、适应性广等特点外源基因的检测1、染色体和基因水平的检测(1)PCR (2)Southern印迹杂交 (3)DNA斑点杂交2、转录水平的检测(1)Northern印迹杂交 (2)RNase保护分析(3)RT-PCR3、蛋白质水平的检测 Western印迹杂交报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基
14、因,通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控. 由于具有灵敏度高、检测方便等特点,报告基因技术有了广泛的应用. 常用的报告基因氯霉素乙酰转移酶基因 荧光素酶基因 绿色荧光蛋白基因 细胞工程1. 定义:在细胞水平运用各种生物技术,能够达到细胞产物或细胞及组织本身的规模生产2. 分类 1. 染色体工程:按照人们需要来添加或削减一种生物的染色体,或用别的生物的染色体来替换。可分为动物染色体工程和植物染色体工程两种2. 染色体组工程:整个改变染色体组数的技术3. 细胞质工程:又称细胞拆合工程,是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开,再进行不同细胞间核质的重新组合,重建新细胞。4. 细胞融合工程:用自
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