高效液相色谱方法及应用.ppt

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1、1高效液相色谱方法及应用2主要内容v绪论v高效液相色谱法的特点v高效液相色谱法的分类v化学键合相色谱v高效液相色谱仪v定性、定量分析基本原理v在药物分析中的应用3 高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography HPLC） 是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 4v经典液相色谱法为基础v引入气相色谱法的理论和实验技术v高压输送流动相v高效固定相及高灵敏度检测器v现代液

2、相色谱分析方法5“三高一广一快三高一广一快”高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻 力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压，一般可达150350105Pa 。高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。 高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng/ml，进样量在uL数量级。 6“三高一广一快三高一广一快”应用范围广：80%以上的有机化合物可用HPLC分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。 分析速度快、载液流速快：通常分析一个样品仅需几分钟到几十分钟的时间，一般小于1小时。 色谱柱可反复使用、样

3、品不被破坏、易回收等优点7 局限性：局限性：v使用多种溶剂作为流动相，成本高于气相色谱法，且易引起环境污染，梯度洗脱操作复杂； v “柱外效应” ：在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低；v高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱；v不能代替中、低压柱色谱法，在200KPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性的生化样品。 81经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n） 分析周期长

4、无法在线检测92HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H，n） 分析时间大大缩短 可以在线检测10HPLC与与GC差别差别相同：兼具分离和分析功能 均可以在线检测不同： 1分析对象的区别 2流动相的区别 3操作条件区别 11HPLC与与GC差别差别1分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测，占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的

5、生化样品及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的80%12HPLC与与GC差别差别2流动相的区别 GC：流动相为惰性气体，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。13HPLC与与GC差别差别3操作条件区别 GC：加温操作 HPLC：室温，高压（液体粘度大，峰展宽小）14HPLC的分类的分类根据分离机制不同分为根据分离机制不同分为: 1

6、、液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography) 2、液液分配色谱法（LLC） (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography ) 3、离子色谱法（IC） ( ion-exchange chromatography and ion pair chromatography) 4、空间排阻色谱法（SEC） ( steric exclusion chromatography )15其他色谱类型其他色谱类型：v亲和色谱（Affinity

7、 Chromatography; AC）v手性色谱法（Chiral Chromatography；CC）v胶束色谱法（Micellar Chromatography；MC）v电色谱法（Electrochromatography；EC）16液液固色谱法固色谱法v固定相：固体吸附剂（如硅胶、氧化铝等，粒度510m）v流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂v基本原理：溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异；分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程17液液固色谱法固色谱法v适用范围：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性v缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾18

8、液液液分配色谱法液分配色谱法固定相与流动相：均为液体（互不相溶），其中固定相是将特殊的液态物质涂于或化学键合于担体表面，常用的载体材料为全多孔型或薄壳型（表面多孔）微粒硅胶吸附剂基本原理：根据被分离组分在固定相和流动相中溶解度不同而分离，分离过程是一个分配平衡过程适用范围：水溶性和油溶性样品，极性和非极性化合物，离子型和非离子型化合物等19液液液分配色谱法液分配色谱法优点：色谱柱再生方便，样品负载量大，重现性好，分离效果好等缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相可克服上述缺

9、点。现在应用很广泛（7080%）。 20化学键合相色谱化学键合相色谱以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法 (bonded phase chromatography；BPC)化学键合固定相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相正相（正相（normal phasenormal phase，NPNP）和反相（）和反相（reversed phasereversed phase，RPRP）键合相色谱法）键合相色谱法21正相键合相色谱正相键合相色谱 流动相的极性小于固定液的极性分离机制：分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解 吸附：溶质分子与固定相之间定向作用力、

10、诱导力或氢作用力固定相：极性大的氰基或氨基键合相流动相：相对极性小的疏水性溶剂（烷烃类如正己烷、环己烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷等以调节组分的保留时间22正相键合相色谱正相键合相色谱出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱适用范围：中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）23反相键合相色谱反相键合相色谱 流动相的极性大于固定液的极性分离机制：疏溶剂理论-溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。 排斥力强，作用时间，k，组分tR 排斥力弱，作用时间，k，组分tR固定相：极性小的烷基键合相（

11、如C8柱，C18柱）24反相键合相色谱反相键合相色谱流动相：水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间出柱顺序：极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适用范围：非极性和极性较弱的化合物，占整个HPLC应用的80%左右25化学键合色谱具有下列优点：化学键合色谱具有下列优点：1、适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非极性、极性和离子型化合物。2、由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带

12、来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。3、键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。4、固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。26高效液相色谱仪组成组成v输液系统v进样器v色谱柱v检测器v组分收集器v数据获取与处理系统27进样器进样器停留进样装置、手动进样阀（六通阀）、自动进样装置28 检测器检测器示差折光化学检测器 紫外吸收检测器 紫外一可同分光光度检测器 二极管阵列紫外检测器 荧光检测器电化学检测器 29专属型检测器 它对不同组成的物质响应差别极大，因此只能选择性的检测某些物质，如紫外检测器、荧光检测器和电导检测器。通用型检测器 它对大多

13、数物质的响应相差不大几乎适用于所有物质，如示差折光化学检测器 。但它的灵敏度低，受温度影响波动大、使用时有一定局限性。30紫外吸收检测器 简称紫外检测器（ ultraviolet absorption detector ，UV），是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器。 因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外吸收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的检测器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。 它不仅有较好的选择性和较高的灵敏度，而且对环境温度、流动相组成变化和流速波动不太敏感，因此既可用于等度洗脱，也可用于梯度洗脱。31检测原理：朗伯比尔 (Lambert-Beer) 定律

14、，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=Cl特点：灵敏度较高（10-6-10-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品，应用广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用 ）局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长 专属型、浓度型检测器32示差折光检测器示差折光检测器 v凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测v糖类化合物的检测大多使用此检测系统v这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7gml）v流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测33荧光检测器

15、荧光检测器 v凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比v只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定 柱前或柱后衍生v其灵敏度很高（检测下限为10-1210-14gml）v痕量分析和梯度洗脱样品的检测均可采用 34从色谱流出曲线中可以得出许多重要信息：从色谱流出曲线中可以得出许多重要信息： 样品所含组分的最少个数； 定性分析（保留值）； 定量分析（峰高或面积）； 分离效能（保留值及区域宽度）； 两相选择的依据（峰间距离）35HPLC定性分析的基本原理定性分析的基本原理 在同一个色谱条件下，不同样品内所含有的同一物质，在色谱柱内

16、具有相同的作用机理和平衡参数，因此，具有相同的色谱保留行为，反映在色谱图上就是有相同的保留时间，这就是高效液相色谱仪定性的依据。36 但是，由于色谱柱内，被分析物质和固定相、流动相之间作用的复杂性，以及色谱柱的分离能力-柱效的局限，有些物质是不能分离或是完全分开，因此出现在同一或是相近的保留时间内。色谱的这种定性的局限性概括为：在同一色谱条件下，同一物质具有相同的保留时间，而同一保留时间并不说明是同一物质。 37 为提高高效液相色谱的定性能力，通常使用一些具有较强定性能力的检测器，如：液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）,液相色谱-紫外可见光扫描检测器（HPLC-PDA），液相色谱-红外、核磁联

17、用仪等。通过这些检测器可对每一组分进行定性分析。38定量分析的基本原理定量分析的基本原理 当一个样品在色谱柱内被分离成几个组分以后，每个组分依次流经检测器，经检测得到相应的色谱图。色谱图中各个组分的响应值，也就是色谱峰的一些性质如峰高、峰面积是定量分析的基本依据。39 以常用的紫外-可见光检测器为例：由于紫外-可见光检测器(UV-Vis检测器)与分光光度计的基本原理一致，在一定的浓度范围内都服从比尔定律（Beers law）: a=ebc 其中，a：吸光度；e：该物质的摩尔吸光系数；b：光程；c：该物质的浓度。 40在一定的浓度范围内，有 C=kA+b C：样品中该物质的浓度，A:该物质对应的

18、峰面积，k、b为常数。 也就是说，被分析样品内某一物质的浓度和该物质所对应的峰面积成正比，这就是高效液相色谱定量分析的基本原理。41在药物分析中的应用 1.在鉴别中的应用在鉴别中的应用 在HPLC法中，保留时间与组分的结构和性质有关，是定性的参数，可用于药物的鉴别。如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。头抱拉定、头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别。 422.在杂质检查中的应用在杂质检查中的应用 HPLC分离效能高，灵敏，在药物的杂质检查中应用广泛。主要用

19、于药物中有关物质的检查。 “有关物质有关物质”是指药物中存在的合成原料、中间体、副产物、降解产物等物质，这些物质的结构和性质与药物相似，含量很低，只有采用色谱的方法才能将其分离并检测。 若杂质是已知的，又有杂质的对照品，可用杂质对照品做对照进行检查。若杂质是未知的，可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查。433在含量测定中的应用在含量测定中的应用 用高效液相色谱法测定含量可以消除药物中的杂质，制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰。中药材及其制剂组成复杂，基中不少有效成分的含量测定也越来越多地采用了高效液相色谱法。4.手性分离手性分离445.在血药浓度检测中的应用在血药浓度检测中的应

20、用 用HPLC测定可疑中毒病人血中药物浓度具有准确、快速的优点，可有效地帮助临床医生确诊，快速有效地救治患者，对提高医疗质量有重要意义。血液、组织中药物的浓度，在药物代谢动力学研究、临床血药浓度检测中应用非常广泛。45 对乙酰氨基酚血药浓度测定对乙酰氨基酚血药浓度测定色谱条件：采用Nova-PakC18柱（4 um,150mm3.9mm） 柱温25 流动相为甲醇-水（30:70） 流速为0.8ml/min 二极管阵列检测器，检测波长254nm。血浆样品制备： 取静脉血3ml4ml，置含肝素抗凝剂的离心管中，离心分离5min（3000r/min），上清液为待测血浆。取上述血浆1ml，加饱和硫酸锌

21、溶液1ml，沉淀蛋白后，加入乙醚5ml，涡漩混合1min，离心20min（3000r/min）。精密吸取乙醚液3.0ml于50氮气流吹干，冷至室温，以蒸馏水500 uL溶解残渣，取10 uL进样。46对照品溶液制备：配制对乙酰氨基酚甲醇溶液（10mg/ml），并用甲醇逐级稀释成浓度为0.01mg/ml5mg/ml的对照品溶液，4冰箱存放备用。标准曲线制备; 取肝素抗凝的血浆1ml，分别加入不同浓度的对乙酰氨基酚工作液100 uL ，使血浆中药物浓度为0.9 ug/ml454.5 ug/ml，再按“血浆样品制备”项下方法操作，记录色谱图，以溶液C对峰面积A作线性回归，得回归方程：A=1.64104+1.68107C，R=0.9995，线性范围为0.9 ug/ml454.5 ug/ml，最低检测浓度为0.9 ug/ml(以信噪比3计)。 47 谢谢大家！