高效液相检测器.ppt

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1、 检测器的选择与应用检测器的选择与应用高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器 最常用的液相色谱检测器依次是紫外最常用的液相色谱检测器依次是紫外检测器、检测器、示差折光检测器、示差折光检测器、荧光检测器、荧光检测器、安培检测器和蒸发光散射检测器等。安培检测器和蒸发光散射检测器等。 检测器是高效液相色谱仪的三大关检测器是高效液相色谱仪的三大关键部件之一。按其适用范围检测器可分键部件之一。按其适用范围检测器可分为通用型和专属型两大类。为通用型和专属型两大类。 专属型检测器只能检测某些组分的专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，紫外检测器和荧光检测器属某一性质，紫外检测器和荧光检测器属于这一类，它们只

2、对有紫外吸收或荧光于这一类，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应；通用型检测器检测发射的组分有响应；通用型检测器检测的是一般物质均具有的性质，示差折光的是一般物质均具有的性质，示差折光和蒸发光散射检测器属于这一类。和蒸发光散射检测器属于这一类。理想的理想的HPLCHPLC检测器检测器 高灵敏度；可忽略的基线噪音高灵敏度；可忽略的基线噪音 线性范围宽线性范围宽 独立于流动相及操作参数的响应独立于流动相及操作参数的响应对压力、温度及流速等变化不敏感对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性长时间操作的稳定性 死体积小死体积小 非破坏性非破坏性 选择液相色谱的检测器选择液相色谱的检测器要

3、考虑的因素：要考虑的因素： 你要分离的化合物你要分离的化合物/ /样品的化学特性样品的化学特性化学结构、分子量及紫外光谱等等化学结构、分子量及紫外光谱等等 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） 梯度还是等度梯度还是等度 灵敏度需求灵敏度需求 是否有双检测的需求是否有双检测的需求表表1. 1. 液相色谱常用检测器的一般性质液相色谱常用检测器的一般性质 检测器检测器选择性选择性梯度洗脱梯度洗脱线性范围线性范围最低检测最低检测限限(g/ml)敏感性敏感性 对流速对流速对温度对温度紫外紫外紫外吸收紫外吸收可以可以10521010不敏感不敏感低低示差示差通用型通用型不

4、可以不可以1042107不敏感不敏感104荧光荧光荧光物质荧光物质可以可以1031011不敏感不敏感低低电化学电化学电活性电活性不可以不可以1061012敏感敏感1.5%电导电导离子离子不可以不可以2104108敏感敏感2%一、紫外检测器一、紫外检测器(ultraviolet detector;UVD)(ultraviolet detector;UVD) 紫外检测器是一种应用最广紫外检测器是一种应用最广HPLCHPLC检测器检测器, ,当检测波长范当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外围包括可见光时，又称为紫外- -可见检测器。紫外检测器的可见检测器。紫外检测器的工作原理是朗伯工作原理是朗伯-

5、 -比尔（比尔（Lambert-BeerLambert-Beer）定律。）定律。优点优点：应用最广，对大部分有机化合物有响应；灵敏度高：应用最广，对大部分有机化合物有响应；灵敏度高（检测下限为（检测下限为10-10g10-10gmlml）；线性范围宽；它的最重要特）；线性范围宽；它的最重要特征是对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱。征是对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱。由于灵敏高，因此即使是那些光吸收小、消光系数低的物由于灵敏高，因此即使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用质也可用UV检测器进行微量分析。检测器进行微量分析。缺点：缺点：但它只能检测有紫外吸收的物但它只

6、能检测有紫外吸收的物质，而且流动相有一定限制，即流质，而且流动相有一定限制，即流动相的截止波长应小于检测波长。动相的截止波长应小于检测波长。如果溶剂中含有吸光杂质，则会提如果溶剂中含有吸光杂质，则会提高背景噪音，降低灵敏度。此外，高背景噪音，降低灵敏度。此外，梯度洗脱时或测定波长较短时，基梯度洗脱时或测定波长较短时，基线还会产生漂移。线还会产生漂移。例例1：紫外检测器检测大黄素和大黄酚：紫外检测器检测大黄素和大黄酚 光电二极管阵列光谱检测器是紫外检测器的重大光电二极管阵列光谱检测器是紫外检测器的重大进展。采用这种检测器可以瞬间实时对流出液进行进展。采用这种检测器可以瞬间实时对流出液进行全光谱检

7、测全光谱检测, , 使提供的信息量大幅度增加。换句话使提供的信息量大幅度增加。换句话说说, , 在一次色谱操作中在一次色谱操作中, , 可同时获得吸光值、流出可同时获得吸光值、流出时间和各组分的紫外时间和各组分的紫外- -可见光谱图在一起的三维谱图可见光谱图在一起的三维谱图, , 提供既定量又定性的色谱信号。吸收光谱用于组分提供既定量又定性的色谱信号。吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量。的定性，色谱峰面积用于定量。光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器(photodiode array detector;PDAD)(photodiode array detector;PDAD)光电二

8、极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 使用二极管阵列检测器，可以对色谱使用二极管阵列检测器，可以对色谱峰进行光谱扫描，峰纯度鉴定的定性分峰进行光谱扫描，峰纯度鉴定的定性分析，在方法研究中可以快速选择最佳检析，在方法研究中可以快速选择最佳检测波长，在多组分混合物分析中可以编测波长，在多组分混合物分析中可以编辑波长程序。辑波长程序。 采用二极管阵列检测器进行论证，也采用二极管阵列检测器进行论证，也是目前常采用的一个强有力的手段。它是目前常采用的一个强有力的手段。它通过对一个色谱峰的数点进行紫外扫描，通过对一个色谱峰的数点进行紫外扫描，然后比较所得到的扫描图谱的接近程度然后比较所得到的扫描图谱的接近程

9、度从而评价被检测峰的纯度。从而评价被检测峰的纯度。 利用二极管阵列检测器进行峰纯度检利用二极管阵列检测器进行峰纯度检查的查的缺点缺点： （1 1）杂质浓度低，或与主成分相比吸收）杂质浓度低，或与主成分相比吸收太小，达不到检测太小，达不到检测灵敏度，无法检测出灵敏度，无法检测出来。来。 （2 2）当杂质的发色团与主成分一致，或）当杂质的发色团与主成分一致，或者说杂质与主组分有相同或几乎相同的者说杂质与主组分有相同或几乎相同的光谱图且具相近的流出时间，此时杂质光谱图且具相近的流出时间，此时杂质也无法发现。也无法发现。例：二极管阵列检测器在农药液相色谱分析中的应用例：二极管阵列检测器在农药液相色谱分

10、析中的应用 液相色谱技术是农药分析的重要手段，二液相色谱技术是农药分析的重要手段，二极管阵列检测器作为液相色谱的检测器也开始极管阵列检测器作为液相色谱的检测器也开始用于农药原药、制剂的分析中。用于农药原药、制剂的分析中。 液相色谱法分析农药样品，绝大多数采用液相色谱法分析农药样品，绝大多数采用紫外检测器，对特定组分往往使用固定波长来紫外检测器，对特定组分往往使用固定波长来检测。这些方法中，色谱峰的保留时间是对组检测。这些方法中，色谱峰的保留时间是对组分定性的唯一依据。但是在分析复杂样品的时分定性的唯一依据。但是在分析复杂样品的时候，仅依靠保留时间定性往往是非常困难的。候，仅依靠保留时间定性往往

11、是非常困难的。在对样品有一定了解的情况下，使用二极管阵在对样品有一定了解的情况下，使用二极管阵列检测器，可以很方便地解决这一问题。列检测器，可以很方便地解决这一问题。 摘自摘自 王骏王骏, ,胡梅胡梅, ,祝建华祝建华. . 二极管阵列检二极管阵列检测器在农药液相色谱分析中的应用测器在农药液相色谱分析中的应用 J . J . 农农药药, 2006, 45 (7) : 466, 469., 2006, 45 (7) : 466, 469.二、荧光检测器二、荧光检测器（fluorescence detector;FDfluorescence detector;FD） 荧光检测器是一种高灵敏的荧光检

12、测器是一种高灵敏的, , 选择性检测器选择性检测器, , 其灵敏度其灵敏度比比UV UV 高高10-100010-1000倍。它适用于检测物质本身具有荧光或为了倍。它适用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光衍生物。原理：有机提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光衍生物。原理：有机共轭芳环分子受紫外光激发后发出荧光。共轭芳环分子受紫外光激发后发出荧光。优点：优点：其灵敏度很高，痕量分析和梯度洗脱样品的检测均可其灵敏度很高，痕量分析和梯度洗脱样品的检测均可采用。可用荧光检测的物质：如某些代谢物、食品、药物、采用。可用荧光检测的物质：如某些代谢物、食品、药物、氨基酸、多肽、生物

13、碱和甾族化合物等。由于荧光检测器的氨基酸、多肽、生物碱和甾族化合物等。由于荧光检测器的高灵敏度和选择性，它是体内药物分析常用的检测器之一。高灵敏度和选择性，它是体内药物分析常用的检测器之一。缺点：缺点：基线稳定需平衡时间较长。基线稳定需平衡时间较长。例：高效液相色谱荧光检测法测定血浆中例：高效液相色谱荧光检测法测定血浆中阿霉素的浓度阿霉素的浓度 本实验中曾采用紫外检测器测定血浆中阿霉素本实验中曾采用紫外检测器测定血浆中阿霉素的含量，波长的含量，波长233nm233nm，但由于杂质峰的干扰较多，但由于杂质峰的干扰较多，改用荧光检测器测定。阿霉素为蒽醌类结构，内标改用荧光检测器测定。阿霉素为蒽醌类

14、结构，内标 - - 萘酚为芳族化合物萘酚为芳族化合物, ,均能发生荧光。大多以荧均能发生荧光。大多以荧光法检测阿霉素含量的文献均选择激发波长在光法检测阿霉素含量的文献均选择激发波长在480nm480nm附近附近, ,发射波长在发射波长在560nm560nm附近附近, ,以寻求最大响应以寻求最大响应值为主要参考值值为主要参考值, ,同时兼顾同时兼顾 - - 萘酚的峰高响应值萘酚的峰高响应值, ,筛选了多对激发筛选了多对激发/ /发射波长发射波长, ,最后确立了在最后确立了在Ex = Ex = 246nm; Em = 555nm246nm; Em = 555nm的波长下进行测定。阿霉素在的波长下进

15、行测定。阿霉素在此条件下响应值最大此条件下响应值最大, ,内标的响应也较明显内标的响应也较明显, ,且杂质且杂质干扰峰明显减少。干扰峰明显减少。 本实验建立的方法快速、简便本实验建立的方法快速、简便, ,内标价廉、内标价廉、易得易得, ,实验所测静脉给药的血药浓度实验所测静脉给药的血药浓度- -时间曲线时间曲线数据与文献报道相一致数据与文献报道相一致, ,表明该法适于临床药表明该法适于临床药浓检测及药物动力学研究。浓检测及药物动力学研究。摘自摘自 安徽科技学院学报安徽科技学院学报, 2008, 22 (5) : 31, 2008, 22 (5) : 313535反相高效液相色谱荧光检测法测定血

16、浆中反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆中阿霉素的浓度阿霉素的浓度例：高效液相色谱荧光法测定荧光衍生物例：高效液相色谱荧光法测定荧光衍生物 二元有机酸是体内脂肪酸代谢的中间产物二元有机酸是体内脂肪酸代谢的中间产物 , ,体内含体内含量增加量增加, ,会引起一系列的病理生理改变和临床症状会引起一系列的病理生理改变和临床症状, ,患患者尿中有机酸含量增加者尿中有机酸含量增加, ,又称为有机酸尿症。由于检测又称为有机酸尿症。由于检测条件的限制条件的限制, , 有机酸尿症诊断较困难。高效液相色谱有机酸尿症诊断较困难。高效液相色谱利用荧光检测器利用荧光检测器, ,通过柱前衍生反应将丙二酸、丁二酸、通过柱前

17、衍生反应将丙二酸、丁二酸、戊二酸转化成相应的含有荧光基团的化合物来测定尿戊二酸转化成相应的含有荧光基团的化合物来测定尿中这中这3 3种有机酸的含量种有机酸的含量, , 其灵敏度高其灵敏度高, ,操作简单操作简单, ,准确度准确度高高, ,可应用于有机酸尿症的诊断与筛查。可应用于有机酸尿症的诊断与筛查。摘自摘自 中国卫生检验杂志中国卫生检验杂志20082008年年1111月第月第1818卷第卷第1111期期高高效液相色谱荧光法测定尿中二元有机酸研究效液相色谱荧光法测定尿中二元有机酸研究三、电化学检测器三、电化学检测器(electrochemical detector;ECD) 电化学检测器包括极

18、谱、库仑、安培和电导电化学检测器包括极谱、库仑、安培和电导检测器等。电导检测器广泛用于离子色谱仪中。检测器等。电导检测器广泛用于离子色谱仪中。应用于能电离成离子物质的检测。响应受温度应用于能电离成离子物质的检测。响应受温度影响较大。影响较大。 安培检测器应用最广泛，其灵敏度很高，安培检测器应用最广泛，其灵敏度很高，尤其适合于痕量组分的分析；凡具氧化还原活尤其适合于痕量组分的分析；凡具氧化还原活性的物质都能进行检测，如活体透析液中的生性的物质都能进行检测，如活体透析液中的生物胺，还有酚、羰基化合物、巯基化合物等。物胺，还有酚、羰基化合物、巯基化合物等。本身没有氧化还原活性的化合物经过衍生化后，本

19、身没有氧化还原活性的化合物经过衍生化后，也能进行检测。也能进行检测。 电化学检测器电化学检测器( Elect rochemical ( Elect rochemical detector) detector) 是根据电化学原理和物质的是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测。在液相色谱中电化学性质进行检测。在液相色谱中, , 它可以检测出所有电活性物质。因此它可以检测出所有电活性物质。因此, , 对部分没有紫外吸收或不能发出荧光但对部分没有紫外吸收或不能发出荧光但具有电活性的物质具有电活性的物质, , 可采用电化学检测可采用电化学检测法进行检测。若在分离柱后采用衍生技法进行检测。若在分离柱后

20、采用衍生技术术, , 还可将它扩展到非电活性物质的检还可将它扩展到非电活性物质的检测。测。例：例：HPLC HPLC 法电化学检测阿奇霉素片的有关物质法电化学检测阿奇霉素片的有关物质 阿奇霉素是近年开发生产的大环内酯类抗生素阿奇霉素是近年开发生产的大环内酯类抗生素, ,中国药典中国药典中阿奇霉素片的有关物质检测方法中阿奇霉素片的有关物质检测方法与阿奇霉素原料药的有关物质检测方法相同与阿奇霉素原料药的有关物质检测方法相同, ,同为同为薄层色谱法薄层色谱法, ,方法检出限、专属性都比较差。故参方法检出限、专属性都比较差。故参考文献采用高效液相色谱考文献采用高效液相色谱(HPLC) (HPLC) 法

21、电化学检测阿法电化学检测阿奇霉素片的有关物质奇霉素片的有关物质, , 结果表明可以定量检出红结果表明可以定量检出红霉素过氧化物、阿奇霉素脱氧化物、阿奇霉素杂霉素过氧化物、阿奇霉素脱氧化物、阿奇霉素杂质质A A 和和N N 脱甲基阿奇霉素等杂质。脱甲基阿奇霉素等杂质。 本文采用本文采用HPLC HPLC 法电化学检测器检测阿奇霉素法电化学检测器检测阿奇霉素片的有关物质片的有关物质, ,方法重现性好、灵敏度高、结果稳方法重现性好、灵敏度高、结果稳定准确。定准确。摘自摘自 中国药房中国药房2008 2008 年第年第19 19 卷第卷第25 25 期期 HPL C HPL C 法电化学检测阿奇霉素片

22、的有关物质法电化学检测阿奇霉素片的有关物质四、蒸发光散射检测器四、蒸发光散射检测器(Evaporative Light-Scatting Mass Detector, ELSD) 蒸发光散射检测器是一种通用型的检测器，根蒸发光散射检测器是一种通用型的检测器，根据散射光强度对样品进行定量分析。据散射光强度对样品进行定量分析。 优点优点：对梯度洗脱和流动相系统的温度变化不：对梯度洗脱和流动相系统的温度变化不敏感；对各种物质的响应因子很接近；在一次分析敏感；对各种物质的响应因子很接近；在一次分析中可以同时检测主要成分和杂质；能解决最困难的中可以同时检测主要成分和杂质；能解决最困难的HPLCHPLC检

23、测问题，如磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树检测问题，如磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物的检脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物的检测；减低流动相溶剂的纯度要求；无需测定定量校测；减低流动相溶剂的纯度要求；无需测定定量校正因子。正因子。例：高效液相色谱蒸发光散射检测法测定例：高效液相色谱蒸发光散射检测法测定归芪口服液中黄芪甲苷含量归芪口服液中黄芪甲苷含量 归芪口服液为虚证类非处方药品归芪口服液为虚证类非处方药品, ,临床用于补临床用于补气生血。其组分为当归、黄芪。现行标准中含量测气生血。其组分为当归、黄芪。现行标准中含量测定方法为薄层扫描法进行测定定方法为薄层

24、扫描法进行测定, ,该方法存在检验周该方法存在检验周期长及重现性、精密度较差的缺点期长及重现性、精密度较差的缺点, ,而因为黄芪甲而因为黄芪甲苷的结构特点苷的结构特点, ,采用采用HPLC HPLC 方法时方法时, ,一般的紫外检测一般的紫外检测器检出效果不理想。建立用器检出效果不理想。建立用HPLC-ELSDHPLC-ELSD法测定归芪法测定归芪口服液中黄芪甲苷的含量口服液中黄芪甲苷的含量, ,本方法操作简便本方法操作简便, ,准确性、准确性、重复性好重复性好, ,适用于本品种的质量控制。适用于本品种的质量控制。摘自摘自 海峡药学海峡药学2008 2008 年第年第20 20 卷第卷第10

25、10 期期高效高效液相色谱蒸发光散射检测法测定归芪口服液中黄芪液相色谱蒸发光散射检测法测定归芪口服液中黄芪甲苷含量甲苷含量五、示差折光检测器五、示差折光检测器（differential refractive index detector）基本原理：基本原理：检测基于被分析物的折光指数的差异检测基于被分析物的折光指数的差异 测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别 当折光指数差异最大时灵敏度也达到最大当折光指数差异最大时灵敏度也达到最大 并不测量绝对的折光指数而是测定折光指数的差别并不测量绝对的折光指数而是测定折光指数的差别典型的应用领域典型的应用领域 没

26、有紫外吸收、荧光的化合物，例如：没有紫外吸收、荧光的化合物，例如： 碳水化合物（碳水化合物（Carbohydrates）、聚合物）、聚合物（Polymers） 脂肪酸（脂肪酸（Fatty Acids）及油脂类（）及油脂类（Lipids）示差检测器的优、缺点示差检测器的优、缺点 优点优点 通用检测器通用检测器 容易使用；通常来说是比较耐用的检测器容易使用；通常来说是比较耐用的检测器 维护成本低维护成本低 缺点缺点 灵敏度低、选择性差灵敏度低、选择性差 对流速、温度及粘度的变化敏感对流速、温度及粘度的变化敏感 不能用于梯度洗脱不能用于梯度洗脱 色谱峰可能是正的，也可能是负的色谱峰可能是正的，也可能是负的 根据随机统计，任何一对液体都会有大约根据随机统计，任何一对液体都会有大约0.07的折光率差异。因此，除非正好被分析的的折光率差异。因此，除非正好被分析的样品与溶液的折光指数完全相同，都会被检测样品与溶液的折光指数完全相同，都会被检测到。到。Separation of Lactose-Reduce MilkMV-20-100102030405060708090100110Minutes4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5葡萄糖乳糖半乳糖 谢谢 谢！谢！