高效液相色谱法简介.ppt

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1、高效液相色谱法高效液相色谱法 High-Performance Liquid Chromatography，HPLC主要内容主要内容l第一节第一节 概述概述l第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪l第三节第三节 高效液相色谱类型高效液相色谱类型l第四节第四节 固定相和流动相的选择固定相和流动相的选择l第五节第五节 图形结果分析及其应用图形结果分析及其应用第一节第一节 概述概述l 高效液相色谱（高效液相色谱（HPLC）也叫高压液相色也叫高压液相色谱（谱（high pressure liquid chromatography）、高速）、高速液相色谱（液相色谱（high speed liquid

2、 chromatography）、）、高分离度液相色谱（高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。）等。l 高效液相色谱法高效液相色谱法是以液体作为流动相的色谱是以液体作为流动相的色谱法，它是利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流法，它是利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流动相相间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分动相相间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分离后进行定性、定量分析。离后进行定性、定量分析。发展历史l 2020世纪初，俄国植物学家茨维特提出经典液相色世纪初，俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。谱法。l 19601960年代

3、，由于气相色谱对高沸点有机物分析的年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。典液相色谱。l 19601960年代末，科克兰（年代末，科克兰（KirklandKirkland）、哈伯、荷瓦）、哈伯、荷瓦斯斯(Horvath)(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。的时代。l 2020世纪世纪

4、7070年代，高效液相色谱法开始广泛应用。年代，高效液相色谱法开始广泛应用。高效液相色谱的特点高效液相色谱的特点l高压高压压力可达150300 kg/cm2。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。 l高速高速流速为0.110.0 mL/min。 l高效高效塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 l高灵敏度高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪基本装置高效液相色谱仪基本装置流动相流动相进样阀进样阀注入样品液注入样品液色谱柱色谱柱检测器检测器色谱处理机色谱处理机高压泵高压泵流出液流出液高效液相色谱

5、仪的组成高效液相色谱仪的组成l 高效液相色谱仪一般可分为高效液相色谱仪一般可分为四四个主要个主要部分：部分：高压输液系统，进样系统，分离系高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统统和检测系统。此外还配有。此外还配有辅助装置辅助装置：如：如梯度淋洗，自动进样、馏分收集及数据处梯度淋洗，自动进样、馏分收集及数据处理等。理等。1 1）贮液器：）贮液器：1-2L1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器的玻璃瓶，配有溶剂过滤器( (NiNi合金合金) )，其孔很小约，其孔很小约2 2 m m，可防止颗粒物进，可防止颗粒物进入泵内。入泵内。2 2）脱气）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通超声波脱气或真空加热

6、脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测气泡会影响检测）。）。1、高压输液系统、高压输液系统3 3）高压泵）高压泵注射型泵注射型泵-输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。恒流泵恒流泵往复型泵往复型泵-造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。高压泵按排液性质可分为：恒压型和恒流型。高压泵按排液性质可分为：恒压型和恒流型。对流量变化敏感的检测器会有噪声对流量变化敏感的检测器会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器。干扰，此时可连

7、接一脉动阻尼器。恒压泵恒压泵-压力恒定，但流量不恒定（现在已经压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用较少使用）。）。（使用较多）（使用较多） 输液泵应具备如下性能：输液泵应具备如下性能：流量稳定流量范围宽输出压力高，一般应能达到150300 kg/cm2；液缸容积小；密封性能好，耐腐蚀。输液泵操作注意事项：输液泵操作注意事项：l 防止固体微粒进入泵体防止固体微粒进入泵体l 流动相不应含有腐蚀性物质流动相不应含有腐蚀性物质l 防止溶剂瓶内的流动相被用完防止溶剂瓶内的流动相被用完l 不超过规定的最高压力不超过规定的最高压力l 流动相一般应该先脱气流动相一般应该先脱气l HPLC有等强度(isoc

8、ratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。 4）梯度淋洗装置：）梯度淋洗装置：l梯度洗脱有两种实现方式梯度洗脱有两种实现方式：l 一是高压梯度（内梯度），一是高压梯度（内梯度），利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合均匀后再进

9、入色谱柱。l 二是低压梯度（外梯度），二是低压梯度（外梯度），通过比例调节阀，将两种不同极性的溶剂按一定的比例抽入一台高压泵中混合，随后打入色谱柱。高压梯度高压梯度低压梯度低压梯度2 2、进样系统、进样系统l 早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。lHPLCHPLC进样方式可分为：进样方式可分为：l （1）隔膜进样l （2）停流进样l （3）自动进样l （4）阀进样l （1）隔膜进样）隔膜进样。使用微量注射器进样。装置简单、使用微量注射器进样。装置简单、死体积

10、小。但进样量小且重现性差，常规分析使用受死体积小。但进样量小且重现性差，常规分析使用受到局限。到局限。l （2）停流进样）停流进样。可避免在高压下进样。但在。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现出现“鬼峰鬼峰”；另一缺点是保留时间不准。在以峰的；另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。l （3）自动进样）自动进样。用于大量样品的常规分析。用于大量样品的常规分析。l （4）阀进样）阀进样。一般一般HPLC分析常用六通进样阀分析常用六通进样

11、阀，其关，其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降（约下降510%左右），但耐高压（左右），但耐高压（3540MPa），进样），进样量准确，重复性好（量准确，重复性好（0.5%），操作方便。），操作方便。图图 六通进样阀六通进样阀 l 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。l 色谱柱色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为26mm，柱长为1050cm，

12、柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。3 3、分离系统、分离系统 色谱柱色谱柱发展趋势： 填料粒度小 柱径小标准柱型： 4.6mm或 3.9mm L: 15-30cm填料粒度：5-10m装柱技术：干法：填料粒度大于装柱技术：干法：填料粒度大于20 m时可用。时可用。 湿法（匀浆法）：配成悬浮液。高压泵压入湿法（匀浆法）：配成悬浮液。高压泵压入 色谱柱，洗净备用色谱柱，洗净备用4 4、检测系统、检测系统l 检测器是检测器是HPLCHPLC仪的三大关键部件之一。其作用仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。是把洗脱液中组分的量转变为电信号。l要求：要求：

13、l 灵敏度高灵敏度高l 噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）l 线性范围宽线性范围宽l 重复性好重复性好l 适用范围广适用范围广分类：分类：l 1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器。l 2）按测量性质可分为通用型和专属型（又称选择性）。通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质，它对溶剂和溶质组分均有反应，如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏度一般比

14、专属型的低。专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，如紫外、荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。l 3）按检测方式分为浓度型和质量型。浓度型检测器的响应与流动相中组分的浓度有关，质量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关。l 4）按破坏性还可分为破坏样品和不破坏样品的两种。la.紫外检测器（紫外检测器（UD）lb.荧光检测器（荧光检测器（FD)lc.示差折光检测器示差折光检测器(RID）ld.安培检测器安培检测器le.电导检测器电导检测器lf.蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器(ELSD)检测器介绍检测器介绍a.紫外检测器(ultraviolet detector)

15、 l UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器，约有80%的物质可以在254 nm或280nm处产生紫外吸收。l 检测原理：检测原理：朗伯比尔朗伯比尔 (Lambert-Beer) (Lambert-Beer) 定律，响应信号定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比（吸光度）与浓度成正比A=Cll 特点：特点：灵敏度较高（灵敏度较高（1010-6-61010-9-9 g/ml g/ml），噪音低，线），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。应用广（分析、制备）。l 局限：局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波只能

16、检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。长应小于检测波长。 l 专属型、浓度型检测器专属型、浓度型检测器石英窗 接色谱柱UV光电倍增管废液l （1 1）固定波长检测器）固定波长检测器 ：254nm254nml （2 2）可变波长检测器）可变波长检测器：光源：氘灯（和钨灯），光源：氘灯（和钨灯）， 200200400400（800800）nmnm，单，单色器，流通池（试样），光电色器，流通池（试样），光电管管光路系统和紫外分光光度计相似光路系统和紫外分光光度计相似 l （3 3）光电二极管阵列检测器）光电二极管阵列检测器 (photodiode (photodiode array

17、detectorarray detector； PDAD)PDAD)：1024个二极管阵列，个二极管阵列，一个二极管对应接受光谱上约一个二极管对应接受光谱上约1nm1nm谱带宽的单色光，谱带宽的单色光，各检测特定波长，计算机快速各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。处理，三维立体谱图。类型：类型：l光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器l 工作原理工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，：复光通过流通池，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获波长的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得得三维

18、光谱色谱图三维光谱色谱图。l 用途用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量用于定量, ,判断峰纯度。判断峰纯度。 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展，如图所示。紫外检测器的重要进展，如图所示。光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器b.荧光检测器荧光检测器(fluorescence detector；FD)l检测原理检测原理：化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称为荧光；的光，称为荧光；荧光强度荧光强度 (F) 与激发光强度与激发光强度 (I0) 及荧光物质浓度及荧光

19、物质浓度 (C) 之间的关系为：之间的关系为： F=2.3QKI0Cl Q为量子产率，为量子产率，K为荧光效率，为荧光效率，为摩尔吸光系数，为摩尔吸光系数，l为光径长度。为光径长度。 F=KC 选择性好，选择性好，专属型检测器，灵敏专属型检测器，灵敏度比紫外检测器高度比紫外检测器高（检测限（检测限10-10 g/ml10-10 g/ml） 对多环芳烃，维对多环芳烃，维生素生素B B、黄曲霉素、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；类化合物等有响应；c. 示差折光检测器示差折光检测器（differential refractive i

20、ndex detector，RID）原理：原理：可连续检测参比池和样品池中流动相之间的可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比；折光指数差值，差值与浓度呈正比； 除紫外检测器之外应用最多的检测器；通用型检除紫外检测器之外应用最多的检测器；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低灵敏度低（10-6g）、对温度敏感、不能用于梯、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种；偏转式、反射式和干涉型三种；d.安培检测器安培检测器 由恒电位仪和一薄层反由恒电位仪和一薄层反应池（体积为应池（体积为15 L）

21、组）组成。如图。成。如图。 原理：原理：利用待测利用待测物流入反应池时在工作电物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物过，此电流大小与待测物浓度成正比。浓度成正比。 采用安培检测器时，采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性测器只能检测具有电活性的物质。的物质。接参比电极接参比电极和对电极和对电极接色谱柱接色谱柱Teflon塑料块塑料块1 cm工作电极工作电极(Pt, Au

22、, 碳糊碳糊)e.e.电导检测器电导检测器 电导检测器主要用于离子色谱的检测。电导检测器主要用于离子色谱的检测。原理：原理：根据待测物在一些介质中电离后所产根据待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当箱中。另外，当pH7pH7时，该检测器不够灵敏。时，该检测器不够灵敏。电导检测器不能用于梯度洗脱。电导检测器不能用于梯度洗脱。f.f.蒸发光散射检测

23、器（蒸发光散射检测器（ELSDELSD）原理：原理：通过检测通过检测光散射光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。特点：特点：消除了溶剂的干扰，不受温

24、度变化影响，灵敏度高，消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检测器。是通用型检测器。蒸发光散射检测器示意图蒸发光散射检测器示意图色谱数据处理色谱数据处理lHPLC通常配有记录仪、积分仪或色通常配有记录仪、积分仪或色谱工作站等，以完成对检测信号的记谱工作站等，以完成对检测信号的记录、处理和控制等。录、处理和控制等。第三节第三节高效液相色谱分高效液相色谱分析法析法一、液一、液- -固吸附色谱固吸附色谱二、液二、液- -液分配色谱液分配色谱三、离子交换色谱三、离子交换色谱四、离子色谱四、离子色谱五、离子对色谱五、离子对色谱六、排阻色谱六、排阻色谱七、亲和色谱七、亲和色谱(AC)(AC

25、)主要分离类型与原理主要分离类型与原理一、一、 液液-固吸附色谱固吸附色谱固定相固定相：硅胶、氧化铝等：硅胶、氧化铝等;流动相流动相：各种不同极性：各种不同极性的一元或多元溶剂。的一元或多元溶剂。基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸; 吸附系数吸附系数K不仅取决于不仅取决于X固相固相与与X液相液相的比值，的比值，还取决于溶剂分子还取决于溶剂分子S的吸附能力。的吸附能力。K大，表示该溶大，表示该溶剂分子吸附能力强，后流出色谱柱，后出峰。剂分子吸附能力强，后流出色谱柱，后出峰。nX固相液相液相固相SXSn K= 二、二、 液液-液分配色谱液分配色谱基

26、本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配：组分在固定相和流动相上的分配不同不同K是分配系数是分配系数，K大，保留时间长，后流出色大，保留时间长，后流出色谱柱。谱柱。 K=流固CC 正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法正相色谱法反相色谱法反相色谱法固定相极性固定相极性高中高中中低中低流动相极性流动相极性低中低中中高中高组分洗脱次序组分洗脱次序 极性小先洗出极性小先洗出 极性大先洗出极性大先洗出三、三、 离子交换色谱离子交换色谱固定相固定相：阴、阳离子交换树脂：阴、阳离子交换树脂流动相流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性：阴离子离子交换树脂作固定相，采用

27、酸性水溶液；反之。水溶液；反之。基本原理基本原理：离子交换树脂上可电离的离子与流动相：离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质进行可逆交换，依据这些离中具有相同电荷的溶质进行可逆交换，依据这些离子在交换树脂上有不同的亲和力而被分离。子在交换树脂上有不同的亲和力而被分离。 阳离子交换：阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 离子交换色谱的分离机理离子交换色谱的分离机理1、qxyP + L PL不足之处不足之处：忽略了在填料表面上形成复合物时：忽略了在填料表面上形成复合物时溶质被流动相中

28、小分子饱和并不断进行计量置溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置换反应的重要因素。换反应的重要因素。2 2、P0 + ZD0 Pb + ZDbP P0 0：流动相中溶质的浓度：流动相中溶质的浓度P Pb b：填料表面上被吸附的溶质浓度：填料表面上被吸附的溶质浓度D D0 0：流动相中洗脱剂的浓度：流动相中洗脱剂的浓度D Db b：填料表面上洗脱剂的浓度：填料表面上洗脱剂的浓度Z Z：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的洗脱剂的数目洗脱剂的数目。K=Pb X (Db)zP0 X (D0)z Z可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数可以小到忽略不计，

29、反应常数变为分配系数Kd=Pb P0 在Z值不能忽略时值不能忽略时K= (Db)z (D0)zKdx在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子KK与保与保留留体积成比例，同时洗脱过程中，体积成比例，同时洗脱过程中，K Kd d， D Db b是常数，是常数，用用K Kz z表示。表示。K= 1 (D0)zKzx 1 D0lgK = lg Kz + Zlg离子交换色谱的影响因素离子交换色谱的影响因素1 1、填料孔径的影响、填料孔径的影响2 2、柱长的影响、柱长的影响3 3、流速的影响、流速的影响4 4、PHPH值的影响值的影响四、四、 离子色谱离子色谱 离子色谱离子色谱

30、是在是在20世纪世纪70年代中期发展起来年代中期发展起来的一中技术，其与的一中技术，其与离子交换色谱离子交换色谱的区别是其的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。法。 五、五、 离子对色谱离子对色谱 原理原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对

31、化合物，使其能够在两相子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配。之间进行分配。 阴离子分离阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化十六烷基：常采用烷基铵类，如氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；三甲铵作为对离子； 阳离子分离：阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子。为对离子。六、六、 排阻色谱色谱排阻色谱色谱 固定相：固定相：凝胶凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)； 原理：原理：按按分子大小和形状分子大小和形状不同不同分离。分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等由其中通过，出峰最慢

32、；中等分子只能通过部分凝胶空隙，分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。故在最后出峰。 七、七、 亲和色谱亲和色谱(AC) 原理：原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所种具有一般反应性能的所谓间隔臂谓间隔臂(环氧、联胺等环氧、联胺等)，再连接上配基再连接上配基(酶、抗原等酶、抗原等)，这种固载化的配基将只，这种固载化的配基将只能和

33、具有亲和力特性吸附能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。留。改变淋洗液后洗脱。载体载体LX配基配基待分离物质待分离物质亲合色谱影响因素亲合色谱影响因素1、平衡和平衡缓冲溶液、平衡和平衡缓冲溶液2、蛋白质的浓度和温度效应、蛋白质的浓度和温度效应3、特异性洗脱、特异性洗脱4、非特异性洗脱、非特异性洗脱 (受缓冲溶液中的受缓冲溶液中的PH值，值， 离子强度，温度和介电常数的控制。离子强度，温度和介电常数的控制。)影响分离的因素与操作条件的选择影响分离的因素与操作条件的选择(一一)影响分离的因素影响分离的因素l 1、在高效液相色谱中在高效液相色谱中,

34、液体的扩散系数仅为气体液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较较小，可以忽略不计，即：小，可以忽略不计，即： H = A + C ul 故液相色谱故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如曲线与气相色谱的形状不同，如下图所示。下图所示。2、流速、流速 流速大于流速大于0.5 cm/s时时, Hu曲线是一段斜率曲线是一段斜率不大的直线。降低流不大的直线。降低流速，柱效提高不是很速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重离度和出峰时间的重要可选择参数。要可选择参数。

35、 3、固定相及分离柱、固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，在高效液相色谱中，分离柱分离柱的制备是一项技术要求非常的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制高的工作，一般很少自行制备。备。（二）分离类型选择（二）分离类型选择 （见下页表）（见下页表）分离类型选择（分离类型选择（choice of separation types）第四节第四节 固定相和流动相的选择固定相和流动相的选择一、固定相一、固定相 1、高效液相色谱固定相、高效液相色谱固定相以承受

36、高压能力以承受高压能力来分类，可分为来分类，可分为刚性固体和硬胶刚性固体和硬胶两大类。两大类。 刚性固体以刚性固体以二氧化硅二氧化硅为基质为基质 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。 2、固定相按、固定相按孔隙深度孔隙深度分类，可分为分类，可分为表面表面多孔型多孔型和和全多孔型全多孔型固定相两类固定相两类固定相的要求：固定相的要求：l颗粒细且均匀；颗粒细且均匀；l传质快；传质快；l机械强度高，能耐高压；机械强度高，能耐高压；l化学稳定性好，不与流动相发生化化学稳定性好，不与流动相发生化学反

37、应。学反应。二、流动相二、流动相 正确选择流动相直接影响组分的分离度正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。性和良好的选择性。（2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外溶剂的紫外截止波长截止波长 要长。要长。 所谓所谓溶剂的紫外截止波长溶剂的紫外截止波长指当小于截止波指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，长的辐射通过溶剂时， 溶剂对此辐射产生溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时

38、溶剂被看作是光学不透明，强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明，它严重干扰组分的吸收测量。它严重干扰组分的吸收测量。（3）高纯度）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生基线不稳，或产生“伪峰伪峰”。（4）化学稳定性好）化学稳定性好（5）低粘度（粘度适中）低粘度（粘度适中） 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采醇和乙腈等；但粘度过低的溶

39、剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。柱或检测器内形成气泡，影响分离。 流动相类别流动相类别按流动相按流动相组成组成分：单组分和多组分；分：单组分和多组分；按按极性极性分：极性、弱极性、非极性；分：极性、弱极性、非极性；按按使用方式使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂有己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙有己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。醇、乙腈、水。 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用）尽量使用高纯度试剂高纯度试剂作流动相，

40、防止微量杂质长期作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。柱子。（3）试样在流动相中应有）试样在流动相中应有适宜的溶解度适宜的溶解度，防止产生沉淀，防止产生沉淀并在柱中沉积。并在柱中沉积。（4）流动相同时还应）流动相同时还应满足检测器的要求满足检测器的要求。当使用紫外检。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。测器时，流动相不应有紫外吸收。 第五节第五节 图形图形结果分析及其应用结果分析及其应用l色谱图色谱图(Chromatogram) :

41、(Chromatogram) :l 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图线图, ,其纵坐标为信号强度其纵坐标为信号强度, ,横坐标为时间横坐标为时间色谱峰色谱峰时间时间( (分分) )基线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值色谱数据处理色谱数据处理分离柱检测器记录仪积分仪色谱工作站色谱仪信号输出方框图色谱数据处理通过色谱数据处理通过ADC转换器转换器, 把模拟把模拟信号转换成数字信号信号转换成数字信号, 然后采用色谱软件处然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。理给出色谱图等信息。 数据处理原理：数据处理原理： 峰的检测峰的检测 数

42、据采集数据采集 基线校正和重叠峰的分离基线校正和重叠峰的分离 自动处理自动处理 人工修正人工修正 峰的检测峰的检测 峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个设一个“阈值阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采用下面两种方式判别峰讯号的变化：测。一般采用下面两种方式判别峰讯号的变化：切线色谱峰的判断 最小面积依照信号斜率依照信号斜率的变化检测信号的变化检测信号依照积分面积依照积分面积检测峰信号检测峰信号 保留时间和峰面积的计算Aa ttn ti iinrr i1 基线校正和重叠峰的分离基线校正和重叠峰的分离 在

43、色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能完全分离的情况。通常采用谷谷规则或预设基线漂移值参数来解决 色谱仪自动定性和定量分析色谱仪自动定性和定量分析 “时间窗时间窗”法法 (Time Window)：tRt 对整个色谱图上各个峰的保留值都设定相同区间“时间窗” ，规定图中各个峰保留时间的变化范围。该法设置简单，但用于识别保留时间相差很近的相邻峰不大方便。 “时间带时间带”法法 (Time Band): tR(1a%) 对每个需识别的定量峰，都设定一个保留时间的相对变动范围。该设置较麻烦，但对不同峰可给出不同的变动范围，对识别相邻峰的分辨率较好，同时用于编组定量分析也很方便。高效液相色谱的定性

44、和定量分析高效液相色谱的定性和定量分析 1.1.定性分析定性分析在液相色谱中保留值定性的方法主要是用直接在液相色谱中保留值定性的方法主要是用直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值（t R或或V R ）与某一已知标准物完全相同时，）与某一已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变洗脱液的组成时，未别是在改变色谱柱或改变洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上认定未知峰与标准物是同相同，则可以基本

45、上认定未知峰与标准物是同一物质。一物质。 2.定量分析定量分析基本方法有基本方法有内标法、外标法等。内标法、外标法等。 外标法外标法标准曲线法标准曲线法 是一种简便、快速的是一种简便、快速的绝对绝对定量方定量方法（归一化法则是法（归一化法则是相对相对定量方法）。定量方法）。首先用欲测组分的标准样品绘制标首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。准工作曲线。具体作法是具体作法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰样，测量各峰的峰面积

46、或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。工作曲线的斜率即为绝对校正因子。l实验仪器的基本操作实验仪器的基本操作l 1、 开机，启动装置，进入开机，启动装置，进入Win2000；开启；开启LC，点击点击Instrumentl online图标，进入仪器控制面图标，进入仪器控制面板，设置所需各项参数。板，设置所需各项参数。 l 2、 设置分析用流动相

47、清洗流路设置分析用流动相清洗流路,等待色谱柱、系等待色谱柱、系统的平衡，基线稳定，开始进样分析。统的平衡，基线稳定，开始进样分析。l 3、 分析结束，数据处理，打印报告。分析结束，数据处理，打印报告。l 4、 关闭柱温箱和检测器，冲洗色谱柱，关闭脱关闭柱温箱和检测器，冲洗色谱柱，关闭脱气机、泵，关闭整个装置。气机、泵，关闭整个装置。l 5、 关闭总电源。关闭总电源。l 6、 在记录本上记录使用情况。在记录本上记录使用情况。高效液相色谱的应用高效液相色谱的应用l高效液相色谱法被广泛应用于分离、分析高效液相色谱法被广泛应用于分离、分析高沸点物质，热稳定性差物质，生理活性高沸点物质，热稳定性差物质，

48、生理活性以及大分子物质以及大分子物质l一、样品测定一、样品测定l1流动相比例调整流动相比例调整：建议第一次检验时请：建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。衡柱。l2样品配制样品配制：溶剂；容器：塑料容器：溶剂；容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品

49、中药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。行硅烷化处理。l3记录时间记录时间：第一次测定时，应先将空白：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。响主峰的

50、测定。l4进样量：进样量：药品标准中常标明注入药品标准中常标明注入10 l，而目前多数而目前多数HPLC系统采用定量环（系统采用定量环（10 l、20 l和和50 l），因此应注意进样量是否一），因此应注意进样量是否一致。（可改变样液浓度）致。（可改变样液浓度）l5计算：计算：由于有些对照品标示含量的方式由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。用有效部位标示，检验时请注意。l6仪器的使用：仪器的使用：l流动相滤过后，注意观察有无肉眼能