怎样用好液相色谱.ppt

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1、怎样用好高效液相色谱,Leo.xu,reservior,injector,pump,column,detector,Data system,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,常见的液相色谱仪问题 色谱峰加宽 分辨率低 裂峰 柱压比预期值高,液 相 色 谱 仪 的 使 用,正确连接液相色谱仪系统可使用户受益，原因如下： 相对比较便宜 不需要花费大量的时间 系统中大多数流体连接均易于检修 通常有助于避免不必要的硬件替换 接头对正确连接至关重要，因此知道接头的 一些基本特点也很重要。,液相色谱仪的正确连接,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头的普通特征 螺纹

2、（10-32， -28， M6x1） 管道外径（1/16”、1/32”、1/8”） 端口几何形状（锥形、平底） 管套直径,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,套圈固定管道，并且始终以相同方式固定用力按入圆锥形端口，如下图所示,套圈锥度 （或角度）,端口锥度 （或角度）,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,然后在套圈接触内套处压紧管壁。,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,通用端口有以下特征： 螺纹 管道尺寸 内部几何形状 但并非所有的接头都是通用的!,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连

3、接,接头要素,管套的深度并非通用!,即使是最好的接头，如果不正确使用也会 产生许多问题。为什么会出现问题？,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头要素,以下示例解释了不匹配的接头导致多种色谱法问题的原因：,如果前端太长，套圈不能密封因而会发生泄漏,如果前端太短，套圈可以密封但是将会导致无效空间和混合的发生,液 相 色 谱 仪 的 使 用,接头要素,液相色谱仪的正确连接,连接出现泄漏后将会引发以下问题： 系统压力损失 注射假象（鬼峰） 出现混合室（死体积）将会引发以下问题： 色谱峰加宽 分辨率减低 显著残留 裂峰 引发色谱法问题的原因很多时，接头不匹配或使用不当将可能导致液相

4、色谱仪的所有主要问题发生!,液 相 色 谱 仪 的 使 用,接头要素,液相色谱仪的正确连接,选择匹配的接头时，应首先清楚以下问题： 使用的端口螺纹类型（例如， 10-32、 -28 等。） 使用的端口几何尺寸 （例如，锥形或平底） 所需连接的管道外径（例如， 1/16”， 1/8”） 是否可以手动紧固连接 接头应与哪些化学药品兼容 接头应该承受多大压力,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,关于液相色谱仪中的管道，以下三个要素必须考虑： 管道的正确型号 管道的最有效尺寸 切割管道的合适工具 如果想获取最好的色谱法效果，必须考虑这三个方面！,液 相 色 谱 仪 的 使

5、用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,如果您想选择适合应用需要的管道类型，请考虑以下问题： 管道在系统中的使用位置 哪种管道材料能够实现最好的兼容性 产生多少压力 可提供多种不同类型的管道 高压管道：不锈钢、PEEK、Radel R、 PEEKsil等。 低压管道: Teflon FEP、 Teflon PFA、Tefzel等。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,选择合适的管道尺寸时，请考虑以下问题： 接受端口需要什么尺寸的管道？ 流速多少？ 管道将会产生多大压力？ 接头提供的管道尺寸是多少？ 请始终注意 -高压管道最常见的尺寸为：1/16” OD x .010”

6、ID -低压管道最常见的尺寸为： 1/8” OD x 1/16” ID,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,这是系统低压、 高流量区域。,这是系统高压、 低流量区域。,这是系统低压、 低流量区域。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,在具体应用中，仅仅选择合适的管道类型和正确的管道尺寸还远远不够，但是 如果管道切割不当， 那么结果可能仍不理想。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,正确的切割技术确实能影响色谱法的质量 不正确切割 正确切割,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,储液器和泵之间的管

7、道连接 管道通常用Teflon材料制造，尺寸为1/8” OD x 1/16” ID。 将管道连接至泵上的接头通常为-28螺纹，平底几何形状。 泵和检测器之间的管道连接 管道通常用PEEK聚合体或不锈钢材料制造，尺寸为： 1/16” OD x .010” ID 或稍小。 将管道连接至系统部件上的接头通常为10-32 螺纹，锥形 几何形状。 检测器之后的管道连接 管道通常用Teflon材料制造，尺寸为1/16” OD,选择正确接头和管道的一般准则,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,管道内径的公英制换算,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,HPLC系统不同部位的

8、管道,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,不同色谱柱的管道使用指南,流动相脱气,吹氦脱气法,加热回流法,抽真空脱气法,超声波脱气法,在线真空脱气法,液 相 色 谱 仪 的 使 用,设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、0.45u或更 细的水性滤膜和有机滤膜 过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵 抽滤 过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞 色谱柱，尤其是使用无机盐配制 的缓冲液。,必须做! 溶剂和水的前处理：过滤,液 相 色 谱 仪 的 使 用,设备和材料：超声波清洗机 脱气的目的：除去流动相中溶解或因混合而产生 的气泡 气泡对测定的影响： 1）柱流量不准 2）检测器基线

9、波动 脱气注意点： 1）每天脱气(无在线脱气器时） 2）混合溶剂脱气时间不能过长,必须做! 溶剂和水的前处理：脱气,流动相过滤头产生的问题,故障特征 “鬼峰”(由已被污染的过滤头造成) 保留时间不断改变(由于过滤头堵塞或部分堵塞),溶剂过滤头的清洗,1.取下过滤头放在(1:4,V/V)的硝酸溶液烧杯中超声清洗15分钟; 2.取出后用蒸馏水超声清洗10分钟; 3.用吸球吹出过滤头中的液体; 4.再用蒸馏水超声清洗10分钟; 5.用吸球吹净过滤头中的水份; 6.将过滤头重新插入溶剂瓶中(正相系统注意将过滤头烘干),溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯,溶剂等级,微量分析、梯度洗脱,都经过蒸馏和0

10、.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒),优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,溶剂纯度的影响,溶剂中的杂质会导致出现“鬼峰”，特别是 梯度洗脱时,注意： 只能使用色谱级的溶剂! 不能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液,注意事项： 溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差，进行样品之前必须进行空白梯度洗脱 ，以辨认溶剂杂质峰。 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器） 每次梯度洗脱之后要对色谱柱进行

11、充分的平衡。,梯度洗脱,溶剂混合产生的问题,流动相中所使用的不同溶剂必须互溶,流动相中溶剂不互溶会导致: 1. 基线漂移， 2. 保留时间的重现性差， 3. 出现肩峰和“鬼峰”的问题.,流路中形成气泡引起的问题,改变保留时间和峰面积 流动相中形成气泡对液流的不良影响 泵中形成气泡使液流波动 峰变形 柱中气泡形成和累积使流动相绕流 尖峰或锯齿状噪声 检测池中气泡形成和累积产生基线噪声,液 相 色 谱 分 析,实验室常备的流动相和固定相,为满足液相色谱的方法选择，实验室应该常备以下的流动相和固定相 （1）流动相：甲醇、乙腈、纯水、四氢呋喃、正己烷二氯甲烷， 这些溶剂基本上能满足90以上的液相色谱分

12、离问题。 （2）固定相：C18键合相柱、硅胶柱、氰基柱合氨基柱。,几点注意事项,色谱柱和流动相确定以后，为想获得满意的色谱分离，可进 一步选择柱长、填料粒度和流速等。需要指出的是某些样品在进 样前要进行很完全的样品预处理，另外，许多样品则需要梯度洗 脱，当色谱条件有所改变时，需要寻找更合适的分离条件。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,流动相及储液器,1.尽量使用HPLC级的溶剂与试剂. 2.最好使用专用的溶剂瓶来放置流动相 3.改变流动相时防止交叉污染. 4.不要使用陈旧的流动相. 5.定期清洗流动相储液瓶. 6.定期清洗烧结不锈钢吸滤头.,液 相 色 谱 仪 的 使 用,对流动相的要求,由于

13、高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力， 并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影 响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选 择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意 选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫 外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此 辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严 重干扰组分的吸收测量。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,对流动相的要求,（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度 也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。

14、痕 量杂质的存在，将使截止波长值增加501OOnm。 （4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。 （5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分 离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于 低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或 检测器内形成气泡，影响分离.,液 相 色 谱 仪 的 使 用,常用流动相的紫外截止波长,液 相 色 谱 仪 的 使 用,常用流动相的强度参数,1. 使用流动相溶解样品 - 减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要 - 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀 2. 进样前最好使用0.45um 的膜进

15、行过滤 如果样品很脏，要使用0.2um的膜进行过滤,样品处理,1-低压计量泵; 1A,1B-时间比例电磁阀; 2-微处理机; 3-混合器; 4-高压输液泵; 5-至色谱柱,6-反馈控制器; 7-混合室; 8-流量计信号; 9-混合溶剂出口,高 压 梯 度,低 压 梯 度,1-程序控制器; 2-溶剂A; 3-溶剂B; 4-高压泵A; 5-高压泵B;,恒流泵中气泡的排除,打开放空阀，按仪器前面板的“冲洗”功能键，用大流量溶剂冲洗系统直到流出的液体连续，证明气泡已经排除； 如果用”冲洗”状态仍不能吸液，可以用吸耳球或注射器在排液口抽吸，直至液体流出； 如果仍然无液体流出，可能是阀球阀座粘连，取出单向

16、阀，向单向阀两端分别吹气，一通一堵为正常，两端均堵说明阀球座粘连，需清洗阀球阀座。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,高压输液泵,1.每次使用后要把泵中的含盐缓冲液洗干净，防止 盐的沉积，泵要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂 中。 2.使用HPLC级的流动相试剂. 3.使用不锈钢烧结吸液滤头. 4.用纯水或双蒸蒸馏水，流量35ml/分，冲洗15分 钟，冲洗时必须打开排放阀（逆时针拧松）,必须做! 使用输液泵的注意事项,液 相 色 谱 仪 的 使 用,操作极限预防,1.严禁在无流动相时启动高压输液泵. 2.设定泵的上限压力(25Mpa)防止长期压力过高 损坏泵和进样阀. 3.设定泵的下限压力(0.51

17、Mpa)防止流动相抽干 和严重泄漏.,输液泵发生故障及相应排除措施,故障 可能原因 解决办法,无流动相流出， 又无压力指示,泵内有大量气体,打开泄压阀，以较大流量（5mL/min)运转，,密封圈损坏,更换,压力和流量不稳,有气泡,打开泄压阀，以较大流量（5mL/min)运转，,单向阀内有异物,稀硝酸超声清洗,压力高,堵,压力低,漏,液 相 色 谱 仪 的 使 用,自动进样器 手动进样器 原理：六通阀 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入,进样器,样品装填状态 (LOAD),手动进样器原理图,注射状态 (INJECT),液 相 色 谱 仪 的 使 用,高压进样阀,必须做! 每次使用后要冲洗干净

18、进样阀中残留的样品和缓冲盐.防 止无机盐沉积和样品微粒磨损阀转子.冲洗方法见进样阀 说明书. 严禁用! 严禁使用气相色谱那样的尖头针进样. 根据情况定 在注射针前加装针式过滤器,防止样品中的微粒进入进样 阀.,手动进样法,一般的方法 1.在进样状态下清洗针口 2.在装填状态下插入微量注射器 3.注入样品 4.切到进样状态 便捷的方法（不需清洗） 1.进样状态下插入微量注射器 2.切到装填状态 3.注入样品 4.切回到进样状态,高效液相色谱检测器,紫外检测器 折光指数检测器 电导检测器 荧光检测器 蒸发激光检测器,检测器的保养,紫外灯的保养：分析前，柱平衡差不多时，打开检测器；在分析完闭后，先关

19、紫外灯。（频繁的开关灯会缩短灯的使用寿命） 样品池要保养 1）用HPLC级溶剂 2）过滤流动相和溶剂 3）脱气 4）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中,液 相 色 谱 仪 的 使 用,紫外检测器,每次做 1.流过池每次使用后连同色谱柱一起清洗. 2.使用脱过气的流动相,防止气泡卡在流过池内. 经常做 3.不定期的用强溶剂反向冲洗流动池(拆开柱子). 4.不定期的使用空流动池校正波长. 根据情况定 5.在流动池出口加装背压阀.,液相色谱仪使用中的问题,预柱与保护柱,从泵来的流动相,预柱,进样器,保护柱,分析柱,到检测器,预柱对流动相而言,保护柱对色谱柱而言,液相色谱仪使用中的问题,良好的柱使用规范,在使

20、用前过滤溶剂 完全润湿在运输中变干的色谱柱 了解溶剂对样品的溶解性及对分离的影响 对含有保留性较强的杂质组份的样品进行预处理 注意柱子的pH使用范围 定期用强极性的溶剂清洗色谱柱 储存色谱柱时要冲尽缓冲液,并用有机溶剂饱和柱子 避免外力损伤色谱柱,如弯曲、跌落等,液相色谱仪使用中的问题,使用保护柱,带整体过滤片的Techtron 保护柱,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱柱,1.流动相或溶剂的化学腐蚀性不能太强. 2.避免样品微粒在柱头沉积. 3.防止过高压力冲击色谱柱. 4.流动相pH大于7时要使用保护柱. 5.正确制备样品,在样品注射器前加装针式过滤器. 6.色谱柱不用卸下前: a.

21、必须洗去缓冲液. b.防止产生微生物 c.用大于10%的有机溶剂充满整个色谱柱. d.柱卸下后用柱堵头将色谱柱首尾密封.,液 相 色 谱 仪 的 使 用,分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性,柱温控制的优点：,使用柱温箱,液 相 色 谱 仪 的 使 用,整台液相色谱仪的维护,1.在使用过含盐缓冲液后必须清水冲洗泵15分钟，此时 必须打开排放阀，不能使废液进入色谱柱。 2.关上排放阀，用90%+10%的水、甲醇溶液冲洗整个系 统，时间为1520分钟，流量1ml/分。本步骤主要是冲 洗干净系统内其他含盐的部位。 3.用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为 1ml/分。本步骤

22、主要是保护色谱柱。 4.如果未使用缓冲液，上面1、2两步骤可免去，直接用 纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/分。,每次用过仪器后必须做!,HPLC的日常操作条件,最好是恒温、恒湿 温度：1530 相对湿度80% 房间应有良好的通风 空调或其他设备产生的气流不要直吹仪器 避免光线直射 远离高电干扰、高振动设备,液 相 色 谱 分 析,分析型液相色谱 定性及定量分析 a.灵敏度的要求 b.样品的复杂性 c.样品量的要求 d.精度及准确度的要求 e.容易使用,液 相 色 谱 分 析,制备型液相色谱 分离及纯化 a.化合物的稳定性 b.样品的复杂性 c.制备量的要求 d.纯度的要求及

23、纯度的鉴定 e.方法的安全性,液 相 色 谱 分 析,Q：需要什么样的分离结果？ A：分辨率高。,液 相 色 谱 分 析,什么是色谱的分辨率？,分辨率R的公式：,液 相 色 谱 分 析,影响分辨率的因素：k，N,分辨率的方程：,k是容量因子，表达了样品与填料的作用强弱。 是选择性系数，描述两化合物分离的好坏程度， 是化学因素。 N是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。,液 相 色 谱 分 析,色谱柱的柱效N,理论塔板数计算公式：,液 相 色 谱 分 析,提高柱效的方法,色谱柱本身 减小填料的颗粒度 找到最佳的流速（根据不同的内径） 合适的温度 降低溶剂的粘度 增加柱长,液 相 色 谱 分 析

24、,其他影响柱效的因素,柱外效应 连接管路 进样器 检测器 进样体积 样品浓度,液 相 色 谱 分 析,容量因子K,与峰高的关系 与R的关系,改变K值的方法： 调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗,k=(tR-t0)/ t0,液 相 色 谱 分 析,选择性系数,定义：,1时两组分分不开，,改变的途径： 改变流动相 改变固定相 改变温度 改变样品的本身性质,液 相 色 谱 分 析,、K、N 如何控制分辨率,原始分离状态,改变 K 后,改变 后,改变 N 后,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,等度分析 色谱柱：C18，4mm30mm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、5

25、0/50、40/60，由强渐弱 流速：2ml/min 样品： 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben),液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,改变容量因子 K,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,改变选择性a,通过改变流动相改变选择性 同样强度的不同溶剂 改变色谱柱,1,2,3,THF/H2O 28:72 MeOH/H2O 58:42 CH3CN/H2O 38:62,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度方法的建立,梯度洗脱的特点 优点 单位时间的分离能力增加 检测

26、灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式 柱需再生 定量分析的重复性较低 分析时间长,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,溶剂 A,溶剂 B,泵 A,泵 B,混合器,A 高压梯度,溶剂 A,泵,溶剂 B,比例阀（溶剂混合点）,混合器,B 低压梯度,（溶剂混合点）,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度洗脱的可变参数,A及B(可能还有C和D液)的 成分和化学特性 梯度的陡度 梯度的变化形状,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,如不用梯度：分离不理想,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度条件的优化,液 相 色 谱

27、 分 析,分析方法建立的实例,梯度曲线的变化凹线,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度曲线的变化凸线,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度平衡时间的影响（一）,10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度平衡时间的影响（二）,平衡时间6分钟,平衡时间7分钟,平衡时间8分钟,平衡时间9分钟,平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,有机污染物的影响（一）,50ml超纯水的有机物污染状态,

28、液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,有机污染物的影响（二）,“三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,有机污染物的影响（三）,典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度方法开发实例 - 第一步,开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100% 水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度方法开发实例 - 第二步,为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），

29、分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度方法开发实例 - 第三步,从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度方法开发实例 - 第四步,空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度方法开发实例 - 第五步,根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的

30、规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度方法开发实例 - 第六步,根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度方法开发实例 - 第七步,最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。,液 相 色 谱 分 析,液相色谱的检测模式,灵敏度、选择性、适应能力,液 相 色 谱 分 析,开发液相色谱分析方法,分辨率是色谱分析中主要考虑的因素。 在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率 之

31、外，以下因素都要考虑。 1.灵敏度 5.成本 2.载样量 6.容易使用 3.分析速度 7.色谱柱寿命 4.溶剂消耗 8.效率,液 相 色 谱 分 析,液相色谱分析方法的建立1,建立液相色谱分析方法通常有以下几步： （1）分子量在样品预处理或GPC分析时有用 （2）选择合适的液相色谱方法（正相、反相或其他）； （3）选择合适的色谱柱； （4）溶解度选择流动相的条件 （5）官能团有否离子化基团？保留特性如何？ （6）样品的基质考虑是否要前处理，如何前处理,液 相 色 谱 分 析,液相色谱分析方法的建立2,续前一页 （7）选择合适的K值的条件； （8）选择良好的峰位（值）； （9）选择良好的色谱柱条

32、件（N值）； （10）检测特性是否有紫外吸收？荧光？ （11）用实测样品解决出现的特殊问题； （12）证实方法的正确性。,液 相 色 谱 分 析,选择液相色谱的方法,主 要 液 相 色 谱 方 法 特 性,液 相 色 谱 分 析,选择液相色谱的方法,次 要 液 相 色 谱 方 法 特 性,液 相 色 谱 分 析,液相色谱的保留,保留时间tR的初步估计： 保留时间tR 死时间t0(1+峰容量因子k） 峰的容量因子k（保留时间tR死时间t0）/死时间t0 t00.5Ld2 左式中： t0进样峰的出峰时间 tR= t0(1+ k) tR峰的保留时间 L柱长(cm) k=(tR-t0)/ t0 d柱内

33、径(cm) k峰的容量因子,液 相 色 谱 分 析,反相色谱不同配比流动相与容量因子值,液 相 色 谱 分 析,溶 剂 强 度,改变流动相的组成或溶剂的强度，就可以改变K和tR。在一定 的条件下，减少保留时间或缩短分析时间的溶剂（小tR和K值）为 强溶剂，增加或延长分析时间的溶剂（大tR和K值）为弱溶剂。例 如，在反相色谱中，水是弱溶剂。在甲醇/水为流动相的系统中增 加甲醇的比例，流动相变强。 液相色谱的溶剂由弱到强排列的顺序为：正己烷、氯仿、二氯 甲烷、甲基叔丁醚、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈、丙醇、甲 醇。 在反相色谱中有机溶剂增加10左右，tR和K值要减少2-3倍。,液 相 色 谱 分

34、 析,峰 位 的 重 排,在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比） 而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的tR，不会发生峰 位重排。在反相色谱中，下列条件改变可能发生峰位重排： （1）流动相中换了强溶剂种类； （2）pH值的改变； （3）柱填料的改变； （4）柱温的改变； （5）流动相组成的改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）,液 相 色 谱 分 析,液相色谱压力计算,（0.46内径柱）,式中 L柱长 流动相粘度 F流速，mL/min dc柱内径，cm dp柱填料直径，m,反相色谱常用流动相的粘度值（mPas）（25）,下表红线框内的数字即为该溶液 与水混合后的粘度（在25时） 即,

35、噪音高或基线漂移,解决问题,可能原因 柱子没有平衡好 杂质组分从色谱柱中缓慢流出 杂质在柱子中的富集 检测器或色谱柱的温度差异 系统有气泡 检测器氘灯需更换 电压不稳造成干扰,解决办法 继续冲洗色谱柱至平衡 利用强极性的溶剂冲洗色谱柱 冲洗色谱柱；提高样品的预处理； 使用色谱纯的溶剂 使用色谱柱恒温箱 流动相脱气； 更换氘灯 使用稳压电源；检查供电系统,出现“鬼峰”,解决问题,可能原因 上一针样品中没有 完全流出的物质 色谱柱被污染 溶剂中有杂质 流动相和溶解样品 的溶剂不互溶,解决办法 待样品中的组分尽可能完全流出后才进下一个 样品；每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲 洗色谱柱；改进样品的预

36、处理 每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲 色谱柱；改进样品的预处理 使用色谱纯的溶剂 尽量用流动相溶解样品；,出现肩峰或 前延峰,解决问题,可能原因 柱头“塌陷”造成死体积 溶解样品的溶剂选择错误 干扰物质的存在； 样品中的杂质 色谱柱过载 柱外效应的影响,解决办法 更换色谱柱 用流动相溶解样品 改进样品预处理； 使用色谱纯溶剂 将样品稀释 检查管路连接,峰形展宽,解决问题,解决办法 更换色谱柱或预柱 减少进样体积；稀释样品 用流动相溶解样品 检查管路连接 检查是否有漏；使用小的检测池 提高色谱柱温度 更换色谱柱,可能原因 色谱柱或预柱被污染或不合适 色谱柱“过载”或进样体积过大 溶解样品的溶

37、剂选用不当 柱外效应的影响 色谱柱和检测器之间有漏； 检测器的检测池过大 色谱柱温度太低； 流动相的黏度太高 色谱柱柱效下降,出现脱尾峰,解决问题,解决办法 减少样品体积； 改进样品预处理； 调节流动相的组成； 使用流动相改性剂（如三乙胺）； 降低流动相的pH值； 使用碱性去活的色谱柱 更换滤网；使用柱前过滤系统； 将样品过滤 检查管路连接 更换色谱柱；,可能原因 色谱柱过载 干扰峰；杂质 硅胶表面未完全键合的 硅羟基的影响 色谱柱的滤网堵塞 柱外效应的影响； 死体积 色谱柱有“塌陷”、短流或断流,出现双重峰或 分叉峰,解决问题,可能原因 样品体积过大； 色谱柱过载 溶解样品的溶剂选用不当 色

38、谱柱有“塌陷”、短流或断流 色谱柱滤网堵塞 进样器没有彻底清洗,解决办法 减少进样体积； 稀释样品； 将样品在流动相中溶解 更换色谱柱； 使用较温和的分离条件 更换色谱柱的滤网； 使用柱前过滤装置； 过滤样品 彻底清洗进样器； 更换进样器转子,保留时间变长,解决问题,可能原因 流速降低 硅胶表面有活性点 键合相流失 流动相的组成有变化 温度降低,解决办法 检查系统是否有漏； 更换泵的密封圈； 排净气泡； 使用流动相改性剂（如加入三乙胺）； 使用碱性去活的色谱柱 保持流动相pH值在2-7.5 范围内 检查泵；检查滤网； 防止流动相的挥发或降解 使用色谱柱恒温箱,保留时间缩短,解决问题,可能原因

39、流速升高 色谱柱过载 键合相流失 流动相组成发生变化 温度升高 色谱柱老化,解决办法 检查泵；检查流速 降低样品的浓度或进样体积 流动相的pH值保持在2-7.5 范围内 检查泵；检查滤网； 防止流动相的挥发或降解 使用色谱柱恒温箱 更换色谱柱； 使用预柱,保留时间 无规则改变,解决问题,可能原因 流速发生变化 色谱柱尚未平衡； 流动相组成发生变化； 流动相中的溶剂互溶性差 色谱柱温度发生变化 杂质在色谱柱中“堆积”,解决办法 检查是否有漏； 更换泵的密封； 排净气泡 至少用10倍柱体积的流动相 平衡色谱柱； 检查泵；检查滤网； 防止流动相的挥发或降解 使用色谱柱恒温箱 冲洗色谱柱；,解决问题

40、漏液的主要原因：,1. 色谱柱未拧紧，多数发生再更换柱后。这时柱温箱会显示Leak。注意，柱温箱的漏液 传感器在两加热块之间的中间位置。请用吸水纸确认，因为有时单用眼观察不易察觉。 2. 连接管路两端未拧紧，或连接管路断裂。 3. 进样阀漏液，如自动进样器转子垫圈磨损造成漏液。 4. 泵漏液，开泵后将手伸入泵底部，可感到漏液。 5. 冷凝水的形成，如果使用柱温箱的降温功能，可能会有冷凝水生成从而使柱温箱显 示漏液。这种情况下可取消柱温箱的检漏功能(在工作站中的instrument 菜单下选择 more column thermostat 然后选择取消柱温箱的检漏功能). 6. 流动池漏液。,解

41、决问题 系统压力过高。,1 首先拧开排液阀，以纯水作流动相并设流速为5ml/min若压力超过 10bar，应先更换排液阀的虑芯。 2 若排液阀的虑芯没有堵塞，卸下色谱柱，然后用一两通代替色谱柱 ，以水作流动相设流速为1ml/min。通常压力不会超过20bar,否则 系统可能有堵塞。 3 若上述的压力超过20bar,我们可按照从后到前的原则，也就是说先 卸下进流动池的连接管接头，开泵后，若压力正常则流动池堵塞 若仍不正常可将这段管另一端也卸下，开泵后再观察压力情况。 同样道理，我们就可以找到堵塞的地方。 容易堵塞的地方：流动池入口管；自动进样器的针及针座；柱温箱,解决问题 系统压力过低，不稳定或

42、没液流。,1 首先拧开排液阀，设流速12ml/min后开泵，观察有无液流，若 有再仔细观察液流是否有倒吸现象如不能确定可用量筒测量流 速的准确性。 2 如上述无液流，或流速不准多数为主动阀阀芯或主动阀故障， 或泵有严重漏液。 3 怎样是大致判断主动阀抑或其阀芯故障？可用以下方法：当泵 运转时用手指轻捏主动主体，正常的主动阀能感到有节奏的脉 动，如果没有， 主动阀有问题。如果有则可以将主动阀阀芯取 出进行超声波清洗，如仍有问题，可更换阀芯。注意，千万不 要把整个主动阀放入超声波清洗这样会损坏主动阀。 4 若上述流速准确但拧紧排液阀后压力不稳定，请仔细检查有无 漏液。(通常漏液地方：各接口包括色谱柱，泵，进样阀等),解决问题 峰面积重现性不好。,1. 首先观察压力是否稳定，以及观察峰面积变化是否有规律。 若压力不稳定，请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过 高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。 2. 若压力稳定但峰面积呈无规律变化，请检查样品是否足够，确认样品的稳定性，必要时 重新配制。检查进样阀是否漏液。等。 3. 若压力稳定且峰面积呈规律变化，多数为色谱柱未平衡好。,THE END,谢 谢,