第四篇.典型发酵工程(过程篇).ppt

《第四篇.典型发酵工程(过程篇).ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第四篇.典型发酵工程(过程篇).ppt（93页珍藏版）》请在一课资料网上搜索。

1、第四篇典型发酵工程 过程篇 第27章抗生素生产工艺 青霉素 第28章氨基酸生产工艺 赖氨酸 第27章抗生素生产工艺 27 1概述 视频抗生素滥用之祸 27 1 1抗生素 微生物 细菌 真菌 放线菌 或动植物在生命活动中产生的 低浓度下选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞的具有生物活性的物质 抗菌 抗肿瘤 抗病毒 抗原虫 抗寄生虫 抗血纤维蛋白溶酶作用 目前人们在生物体内发现的6000多种抗生素 约60 来自放线菌 27 1 2抗生素发展史 抗生素是现代生物学史上最伟大的成就之一 是人们使用最多的药物 也是制药工业中利润最高的产品 世界各国由发酵法生产的抗生素约400种 广泛应用的仅120种

2、抗生素生产为近代微生物技术中最大产业之一 世界产量超过35000吨 不但在经济上占有重要位置 且为人类健康作了出巨大贡献 青霉素 弗莱明发现青霉素是最早发现并用于临床的一种抗生素 1928年英国人FIeming发现 20世纪40年代投入工业生产 它能有效地控制伤口的细菌感染 在二战期间挽救了数百万战争中受伤者的性命 推动抗生素发展 牛津大学病理学教授弗洛里 钱恩等优秀的化学家 1952年的诺贝尔生理学或医学奖颁发给塞尔曼 亚伯拉罕 瓦克斯曼 SelmanAbrahamWaksman 他发现了链霉素 第一有效抗生素用于治疗肺结核 27 1 3抗生素的分类 抗生素的分类 27 2抗生素工业发酵生产

3、过程 1 生物合成法 传统方法 工程菌 制造法 细胞融合技术法2 化学合成法 3 生物合成 化学合成法 生产方法 27 2 1生物合成法 传统方法 多数抗生素是由放线菌和霉菌产生菌种从土壤中分离 筛选获得 采用深层通风搅拌发酵罐生产 由于传统方法存在很多不足 人们采用基因工程和细胞融合技术 对抗生素产生菌进行了改造 可以制造出许多高效低毒的新型抗生素 通过改革工艺 使抗生素产量成倍地增长 工程菌 制造法第一次由 工程菌 制造的全新抗生素 麦迪紫红素A是美国报道的 将产放线紫红素的部分基因插入产麦迪霉素的放线菌中 构建的 工程菌 产生了全新的抗生素 我国新构建的生产丁胺卡那霉素的 工程菌 就是把

4、酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的 新的 工程菌 生产的新抗生素毒副作用小 对耐卡那霉素 庆大霉素致病菌临床疗效显著 细胞融合技术法对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突出 橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原菌株提高100倍 目前DNA重组技术已广泛用于红霉素 链霉素等20多种抗生素的育种工作 不久将来会有更多的由 工程菌 生产的新型抗生素问世 27 2 2化学合成法根据某种抗生素的化学组成和结构 通过化学合成的方法 可生产部分抗生素 如氯霉素 磷霉素等 经过化学合成方法和控制条件的不断深入研究 越来越多的抗生素可用化学合成法生产 27 2 3生物合成加化学合成法许多细菌逐渐出

5、现了抗药性 证实某些抗药性因子位于细菌内的质粒上 质粒在细菌之间转移使抗性菌日益增多 抗生素疗效就越来越低 为对付细菌的抗药性 科学家对抗生素进行了 整容手术 细菌因再无法识别改头换面的抗生素而被抑制或杀死 现在已能使用克隆了酰化酶基因的 工程菌 大肠杆菌 高效率的生产半合成抗生素 临床现在使用的特效药物先锋霉素 头孢菌素类 氨苄青霉素就是这类半合成抗生素类药物 生产前期研究 产生菌的筛选抗菌性试验提取 精制 鉴定毒性试验药理和临床试验 微生物发酵生产抗生素的基本过程 菌种 孢子制备 种子准备 发酵 发酵液过滤与预处理 提取及精制 成品包装 Fleming分离的点青霉 只能产生2U ml青霉素

6、 目前全世界用于生产青霉素的高产菌株 大都由一种产黄青霉菌株经不同改良途经得到 20世纪70年代前育种 诱变和随机筛选方法 现在原生质体融合技术 基因克隆技术青霉素工业发酵已达80000U ml 生产菌株一般在真空冷冻干燥状态下保存其分生孢子 也可用甘油或乳糖溶剂作悬浮剂 在 70 冰箱或液氮中保存孢子悬浮液和营养菌丝体 27 3青霉素生产工艺 青霉素类的基本结构 由母核6 氨基青霉烷酸 6 amino penicillanicacid 6 APA 及侧链组成 侧链不同形成不同青霉素 抗菌能力不同6 APA是由一个噻唑环 A 连结 内酰胺环 B 组成 B A 青霉素的分类 青霉素G类 如青霉素

7、G钾 青霉素G钠 长效西林等 青霉素V类 别名苯氧甲基青霉素 苯氧乙酰胺基青霉烷酸 如青霉素V钾等 耐酶青霉素 如苯唑青霉素 新青 号 氯唑青霉素等 广谱青霉素 如氨苄西林 阿莫西林等 抗绿脓杆菌的广谱青霉素 如羧苄西林 哌拉西林钠 呋苄青霉素等 氮咪青霉素 如美西林及其酯匹美西林等 其特点为较耐酶 对某些阴性杆菌 如大肠杆菌 克雷伯菌和沙门菌 有效 但对绿脓杆菌效果差 青霉素生产流程 冷冻干燥孢子 琼脂斜面 米孢子 种子罐 一 二级 发酵罐 预处理 过滤 乙酸丁酯萃取 蒸发 脱水脱色 结晶 工业盐 综合利用 27 3 1菌种 产黄青霉 Penicilliumchrysogenum 产绿色 黄

8、色孢子 生长发育分7个阶段 期 分生孢子萌发 期 菌丝繁殖 期 脂肪粒形成 期 脂肪粒减少 中 小空孢 期 形成大空孢 脂肪粒消失 期 细胞内没有颗粒 菌丝体自溶 期 菌丝生长期 期适宜做发酵种子 期 青霉素分泌期 期到来之前结束发酵 种子制备阶段以生产丰富的孢子 斜面和米孢子培养 或大量健壮的菌丝体 种子罐培养 为目的所以 要在培养基中加入丰富的 容易代谢的碳源 如葡萄糖或蔗糖 氮源 如玉米浆 缓冲pH的碳酸钙以及生长所必需的无机盐 并保持最适生长温度 25 26 和充分通气 搅拌 种子制备的培养条件及原材料质量均应严格控制以保持种子质量的稳定性 27 3 2培养基 碳源 乳糖 蔗糖 葡萄糖

9、等 淀粉水解糖 通常采用葡萄糖和乳糖 发酵初期 利用葡萄糖使菌丝快速生长 当葡萄糖耗竭后 利用乳糖 分泌青霉素 氮源 玉米浆 花生饼 棉籽饼 麸皮粉 氯化铵 硫酸铵 硝酸铵 前体 苯乙酸或苯乙酰胺 多次流加 每次 0 1 无机盐 S P Ga Mg K等 铁离子有害 控制在 30 g ml 27 3 3发酵工艺过程 1 生产孢子的制备保藏的孢子 活化 25 26 6 8d 获得单菌落 25 26 7d 获得斜面孢子 制得小米或大米孢子 优质小米或大米固体培养基25 7d 每批孢子必须进行严格摇瓶试验 测定效价及杂菌情况 2 种子罐和发酵罐培养工艺 青霉素生产采用三级发酵 一级种子培养 接种小米

10、孢子 萌发形成菌丝 培养基成分为葡萄糖 蔗糖 乳糖 玉米浆 碳酸钙 玉米油 消沫剂等 通无菌空气 空气流量1 3 V V 300 350r min 培养时间40 50h pH自然 温度 27 1 二级种子培养 菌丝体大量繁殖 培养基成分为玉米浆 葡萄糖等 通无菌空气 空气流量1 1 1 5 V V 250 280r min pH自然 25 1 培养时间10 14h 三级发酵培养 培养基为花生饼粉 高温 麸皮 玉米浆 葡萄糖 尿素 硫酸铵 硫酸钠 硫代硫酸钠 磷酸二氢钠 苯乙酰胺 碳酸钙及消泡剂等 接种量为12 15 青霉素的发酵对溶氧要求极高 通气量偏大 通气比控制1 0 7 1 8 V V

11、150 200r min 100m3的发酵罐搅拌功率为200 300kW 罐压控制0 04 0 05MPa 25 26 下培养 前60h pH5 7 6 3 温度26 以后pH6 3 6 6 温度24 发酵周期为200h左右 27 3 4发酵条件控制补糖 残糖降至0 6 pH上升时开始加糖 补氮 发酵液氨态氮0 01 0 05 补硫铵 氨水或尿素补前体 发酵液中残存乙酰胺0 05 0 08 pH控制 前期pH5 7 6 3 中后期6 3 6 6 通过进行调节通过加糖 加酸 加碱补加氨水调节 温度控制 前期 25 26 后期 23 通风比 1 0 8vvm 单位培养液体积在单位时间内通入的空气量

12、 溶氧 发酵液中的溶氧 氧饱和溶解度的30 消沫剂 添加玉米油 豆油或化学消沫剂 泡敌 少量多次 27 3 5青霉素的分离纯化 1 预处理 浓缩目的产物 去除大部分杂质 改变发酵液的流变学特征 利于后续的分离纯化过程 2 过滤 加入絮凝剂 转鼓式真空 吸滤 洗涤 吸洗液 刮除滤饼 除掉菌丝体及部分蛋白质 3 萃取 溶媒萃取法 二级逆流工艺或二级顺流工艺 青霉素游离酸易溶于有机溶剂 而青霉素盐易溶于水 工业上通常用乙酸丁酯和戊酯 萃取2 3次 浓缩10倍 浓度几乎达到结晶要求 4 脱色 加活性碳150 200g 10亿单位 5 精制 乙酸丁酯萃取液用0 5mol L氢氧化钠萃取 调pH6 4 6

13、 8 得青霉素钠盐浓缩液 5万单位 ml 加3 4倍体积的丁醇 16 26 5 110mmHg下真空蒸馏 将水 丁醇共沸物蒸发出去 浓缩到青霉素钠盐浓缩液的体积 蒸出馏分中含水量为2 4 时 停止蒸馏 青霉素钠盐结晶析出 过滤 洗涤得到成品 6 溶媒回收 各种有机溶剂回收 以降低成本 减少环境污染 第28章氨基酸生产工艺 28 1概述氨基酸是蛋白质的基本结构单位 在自然界已发现组成各种蛋白质的氨基酸有二十多种 其中苏氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 赖氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸及色氨酸八种氨基酸是人类本身不能合成的必需氨基酸 只能从食物中摄取 氨基酸在食品 医药 饲料 化工 农业 化妆品等领域广泛应

14、用 氨基酸的生产方法主要有抽提法 化学合成法 微生物发酵法和酶法四种 到目前为止 60 以上的氨基酸采用微生物发酵法进行生产 其中产量最大的是谷氨酸 其次是赖氨酸 氨基酸的生产方法 抽提法 将蛋白质原料进行水解 然后从水解液中抽提氨基酸 是生产氨基酸最早采用的方法 水解方法有酸法水解 碱法水解和酶法水解 目前胱氨酸 半胱氨酸和酪氨酸仍用抽提法生产 化学合成法 用化学合成的方法制造氨基酸 目前用化学合成法制造的氨基酸有DL 蛋氨酸 DL 丙氨酸 甘氨酸和苯丙氨酸 微生物发酵法 是目前氨基酸生产最常用的方法 根据微生物本身具有合成氨基酸的能力的特点 通过菌株的筛选 诱变处理及代谢调节来达到合成某种

15、氨基酸的目的 发酵法分为直接发酵法和添加前体发酵法 酶法 利用微生物细胞或微生物产生的酶进行生物催化反应制造氨基酸的方法 赖氨酸 色氨酸 天门冬氨酸 酪氨酸 丙氨酸等均可用酶法生产 采用固定化酶或细胞连续生产 其优点更突出 28 2氨基酸发酵工艺控制 28 2 1菌种 氨基酸发酵的菌种主要有谷氨酸棒状杆菌 黄色短杆菌 乳糖发酵短杆菌 短芽孢杆菌 黏质赛氏杆菌等 下页为一些氨基酸生产菌种及用途 28 2 2培养基培养基一般都包括碳源 氮源 无机盐 生长因子 水等成分 发酵培养基的成分与配比是决定氨基酸产生菌生长 代谢的主要因素 与氨基酸的产率 转化率及收率的关系密切 一些氨基酸的生产菌种及用途

16、1 碳源氨基酸发酵中可采用淀粉水解糖 糖蜜 醋酸 乙醇 烷烃等多种碳源 根据微生物菌种的性质 氨基酸种类和发酵工艺方法 选择碳源种类和浓度 最常采用的是淀粉水解糖液或糖蜜 2 氮源氨基酸发酵培养基常选用铵盐 尿素 氨水等为无机氮源 几乎所有的氨基酸产生菌都是生物素缺陷型 同时也是一些氨基酸的营养缺陷型 而且大多数氨基酸产生菌都不能分泌胞外水解蛋白酶 因此需要添加适量的有机氮源如玉米桨及精制棉籽饼 麸皮 豆饼等蛋白质原料的水解液 3 碳氮比氨基酸发酵时 不仅菌体生长和氨基酸合成需要氮源 而且氮源还用来调节发酵液的pH值 例如谷氨酸发酵的碳氮比为100 15 21 当碳氮比为100 11时才开始积

17、累谷氨酸 因此发酵培养基氮源的需要量比一般发酵多 谷氨酸发酵消耗的氮源中 合成菌体用的氮源占总氮的3 6 合成谷氨酸的氮源占30 80 实际生产中 以尿素或氨水为氮源时 除了一部分用于调节发酵液的pH值外 还有一部分随空气逸出 为此氮源的用量更大 谷氨酸发酵培养基中当糖浓度为12 5 总尿素量为3 时 碳氮比为100 28 氮源的用量对氨基酸生物合成产生显著的影响 如谷氨酸发酵中 适量的NH4 可减少 酮戊二酸的积累 促进谷氨酸的合成 过量的NH4 会使生成的谷氨酸转化为谷氨酰胺 4 无机盐发酵培养基中通常需要加入硫 磷 钙 镁 钾等无机盐类 磷酸盐浓度对于氨基酸发酵的影响极为显著 而镁 钾等

18、离子是许多酶的激活剂 对菌体的生长和氨基酸的积累有重要的作用 5 生长因子生物素是氨基酸发酵生产中重要的生长因子 影响细胞膜的通透性和代谢途径 它的浓度与微生物菌体的生长和氨基酸的合成关系密切 以淀粉水解糖为原料进行谷氨酸发酵时 必须控制生物素的浓度为亚适量 以2 5 g L为宜 实际上是控制玉米浆的浓度 保证菌体细胞膜的通透性良好 谷氨酸才能大量分泌 在天门冬氨酸族氨基酸 如赖氨酸 苏氨酸 蛋氨酸等 的发酵中期望菌体细胞膜完整 要求控制生物素过量 如赖氨酸发酵中添加过量的生物素 200 500 g L 赖氨酸合成显著增加 氨基酸发酵一般以玉米浆 麸皮水解液 甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜作为生物素的来源

19、 28 2 3发酵条件控制 1 pH值对氨基酸发酵的影响及控制pH值影响酶的活性和菌的代谢 谷氨酸发酵中 在中性和微碱性条件下 pH7 0 8 0 积累谷氨酸 在酸性条件下 pH5 0 5 8 则易形成谷氨酰胺和N 乙酰谷氨酰胺 发酵前期pH值偏高对菌体生长不利 糖耗慢 发酵周期延长 反之 pH值偏低则菌体生长旺盛 糖耗快 不利于谷氨酸合成 但发酵前期pH值偏高 pH7 5 8 0 对抑制杂菌有利 故控制发酵前期的pH值以7 5左右为宜 由于谷氨酸脱氢酶的最适pH值为7 0 7 2 氨基转移酶的最适pH值为7 2 7 4 因此控制发酵中后期的pH值为7 2左右 生产上控制pH值的方法一般有两种

20、 流加尿素和流加氨水 少量多次 可使pH值较稳定 流加尿素的数量和时间主要根据pH值变化 菌体生长 糖耗情况和发酵时期等因素来决定 如当菌体生长和糖耗均缓慢时 要少量多次地流加尿素 避免pH值过高而影响菌体生长 菌体生长和糖耗均较快时 流加尿素可多些 使pH值适当高些 以抑制生长 发酵后期残糖很少 接近放罐时应尽量少加或不加尿素 以免造成浪费和增加氨基酸提取难度 不同的氨基酸发酵对pH的要求见下页表 不同氨基酸发酵的最适pH和溶解氧分压 2 温度对氨基酸发酵的影响及控制氨基酸发酵的最适温度因菌种和所生产的氨基酸种类不同而异 氨基酸发酵一般属于Gaden分类的 型即生长部分偶联型发酵 菌体生长到

21、一定程度后再开始产生氨基酸 菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的 如谷氨酸发酵 菌体生长最适温度为30 32 谷氨酸合成的最适温度为34 37 如果菌体生长阶段温度过高 则菌体易衰老 在发酵中后期 菌体生长已基本停止 需要维持最适的产酸温度 以利谷氨酸的合成 3 溶氧对氨基酸发酵的影响及控制不同的氨基酸发酵对溶氧的要求不同多数氨基酸发酵是在供氧充足的条件下进行的 如谷氨酸 谷氨酰胺 脯氨酸和精氨酸等 也有一些氨基酸的发酵过程需要限制供氧 如亮氨酸 苯丙氨酸和缬氨酸等发酵适宜在缺氧条件下进行 只有当菌体呼吸在一定程度上受阻时才最适合这些氨基酸的生产 而赖氨酸 异亮氨酸 苏氨酸等的发酵需

22、氧量介于上述两者之间 发酵的不同阶段氧分压的要求也是不同的 因此在发酵过程中应根据具体情况对供氧进行控制 4 泡沫的控制发酵过程中通常产生大量的泡沫 可采用豆油 玉米油等天然油脂或环氧丙烯 环氧乙烯 聚醚类等化学消泡剂进行消泡 并控制消泡剂的用量和加入的时间与方法 否则影响菌体的代谢和产物的提取 28 3氨基酸分离纯化 氨基酸的分离和纯化又称为氨基酸发酵液的后处理或下游工程 downstreamprocessing 是氨基酸工业生产中的一个重要组成部分 发酵法生产氨基酸的发酵液是极其复杂的多相体系 含有微生物菌体细胞 代谢产物 未消耗尽的培养基等 因此要提取高纯度的氨基酸 氨基酸的分离纯化 对

23、氨基酸发酵液进行预处理 菌体分离 初步纯化 高度纯化等步骤 前三步骤称为分离 或提取 处理的体积较大 着重于分离和浓缩 高度纯化称为纯化 或精制 精细的分离操作 着重于纯化 氨基酸的分离纯化工艺流程 28 4赖氨酸生产工艺 赖氨酸是人体必需的8种氨基酸之一 人和高等动物体内不能合成 自1960年日本用谷氨酸棒状杆菌的高丝氨酸营养缺陷型突变株发酵生产赖氨酸获得成功后 微生物发酵法成为生产赖氨酸的主要方法 赖氨酸有L型和D型 种构型 微生物发酵法生产的均为L型 28 4 1赖氨酸的生产菌种与生物合成途径 1 细菌 如短杆菌属 黄色短杆菌 乳糖发酵短杆菌 和棒状杆菌属 谷氨酸棒状杆菌 它们多以谷氨酸

24、生产菌为出发菌株 通过人工诱变获得各种突变株 高丝氨酸营养缺陷型兼AEC抗性突变株 2 酵母菌 如产朊假丝酵母 酿酒酵母 酵母菌赖氨酸的生物合成产率要低于细菌的 目前赖氨酸的发酵生产都是以细菌为生产菌种 赖氨酸合成途径 1 二氨基庚二酸途径 存在于细菌 绿藻 原生动物和高等植物中 P329图28 2 2 氨基己二酸途径 存在于酵母 霉菌中 P329图28 3 28 4 2赖氨酸的发酵条件控制 赖氨酸生产菌多以谷氨酸生产菌为出发菌株 通过选育高丝氨酸营养缺陷型 抗赖氨酸结构类似物 AECr 抗苏氨酸结构类似物 AHVr 的突变株 以解除自身的代谢调节来实现的 赖氨酸发酵是典型的代谢控制发酵 控制

25、培养物中的生物素 L 氨酸和L 甲硫氨酸的含量 温度 pH 溶解氧 通风量 搅拌速度 等条件 赖氨酸大量积累 赖氨酸发酵时间以16 20h为界 分为前 后两个时期 前期 生长期 菌体增殖迅速 有少量赖氨酸生成 糖和氮的消耗主要是用于合成细胞物质及供给菌体的能量代谢 后期 赖氨酸合成期 菌体生长速度明显减慢 L 赖氨酸大量积累 糖和氮消耗主要用于L 赖氨酸的合成 两个阶段在工艺控制上是不同的 1 温度对赖氨酸发酵的影响及控制 在低于20 时 氨基酸合成途径的终产物对第一步反应的酶的反馈抑制作用比在正常生长温度下更大 发酵前期 温度控制在30 32 如果温度过高 菌体容易衰老 发酵液的OD值增长缓

26、慢 耗糖慢 发酵周期延长 赖氨酸产量减少 发酵中 后期产酸阶段 温度可提高至赖氨酸生物合成酶系的最适作用温度32 34 根据菌种 发酵过程可采用二级或三级温度管理 2 pH对赖氨酸发酵的影响及控制 pH对微生物的生长繁殖和代谢产物形成的影响赖氨酸发酵的最适pH为6 5 7 0 一般控制在6 5 7 5 在发酵过程控制pH平稳 赖氨酸发酵过程中 发酵液的pH下降 可以通过流加氨水或尿素来控制 也可加入CaCO3来维持 赖氨酸发酵中 流加尿素容易调节pH 初始尿素浓度一般为0 5 0 6 接种2 3h后 菌体内脲酶分解尿素释放氨使pH上升 随着菌体的生长 培养液中氨与碳源被利用 生成有机酸等中间代

27、谢产物而使pH下降 当培养至14 18h pH降至6 2 6 4时开始流加尿素 流加量为 0 2 0 3 发酵整个过程中共流加3 5次尿素 总量为 1 5 2 5 产酸旺盛期流加量大些 发酵后期残糖量低时少量流加 当残糖量低于2 时就不必流加尿素 3 供氧对赖氨酸发酵的影响及控制 只有在供氧充足的条件下 才大量生成赖氨酸 供氧不足时影响菌体的生长 使赖氨酸产量降低 严重供氧不足 赖氨酸产量很少而积累乳酸 菌体生长阶段 对氧的需求量大于产酸阶段 溶氧分压一般控制在0 4 104 0 8 104Pa 若此时通气和搅拌强度低 氧供给不足 乳酸生成量增加 造成培养基pH低 菌体生长缓慢 菌体量减少 即

28、使在产酸阶段增大通气量 也无法弥补对赖氨酸产量的影响 通气搅拌强度过高 会造成pH高 耗糖快 同样也会出现菌体生长缓慢的现象 降低赖氨酸的产量 当菌体生长进入稳定期以后 溶氧分压控制在0 2 104 0 4 104Pa 直至发酵结束 4 生物素对赖氨酸发酵的影响 生产菌 谷氨酸产生菌的各种突变株 均为生物素缺陷型 发酵培养基中需要生物素作为生长因子 以葡萄糖 丙酮酸为唯一碳源时 添加过量生物素 200 500 g L 可使赖氨酸的积累显著增加 过量生物素使细胞内合成的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制作用增强 抑制谷氨酸的大量生成 使代谢流向合成天冬氨酸的方向进行 因此生物素有促进草酰乙酸生成 增

29、加天冬氨酸供给 提高赖氨酸产量的作用 5 苏氨酸 蛋氨酸对赖氨酸影响及控制 苏氨酸和蛋氨酸是赖氨酸生产菌的生长因子 赖氨酸生产菌缺乏蛋白质分解酶 不能直接分解蛋白质 只能将有机氮源水解后才能利用 大豆饼粉 花生饼粉和毛发水解液通常作为赖氨酸的发酵培养基 如果培养基中的苏氨酸和蛋氨酸丰富 就会出现只长菌 而不产或少产赖氨酸的现象 所以要控制其亚适量 当菌体生长到一定时间后 转入产酸期 6 前体 产物促进剂对赖氨酸发酵的影响 在赖氨酸发酵过程中 添加某些物质可以提高赖氨酸的产量 如谷氨酸棒状杆菌发酵糖蜜生产赖氨酸时 添加与不添加胱氨酸发酵液 赖氨酸的产量分别为55g L 40g L 28 5谷氨酸

30、发酵生产工艺 谷氨酸是一种重要的氨基酸 味精 谷氨酸单钠谷氨酸还可以制成对皮肤无刺激性的洗涤剂 十二烷基谷氨酸钠肥皂 能保持皮肤湿润的润肤剂 焦谷氨酸钠 质量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革 以及人造纤维和涂料等 谷氨酸是目前氨基酸生产中产量最大的一种 谷氨酸发酵生产工艺也是氨基酸发酵生产中最典型和最成熟的 谷氨酸的生物合成途径包括 糖酵解作用 EMP途径 戊糖磷酸途径 HMP途径 三羧酸循环 TCA循环 乙醛酸循环 DCA途径 丙酮酸羧化支路 CO2固定 28 5 1谷氨酸发酵生产的原料 谷氨酸发酵生产以淀粉水解糖为原料 淀粉水解糖的制备一般有酸水解法和酶水解法 水解糖液要求 糖液中还原糖的含量

31、要达到发酵用糖的标准 糖液洁净 杏黄色或黄绿色 有一定的透光度 糖液中不含糊精 糖液不能变质 28 5 2谷氨酸发酵生产的菌种 主要有棒状杆菌属 短杆菌属 小杆菌属及节杆菌属的细菌 除节杆菌外 其他三属中有许多菌种适用于糖质原料的谷氨酸发酵 这些细菌都是需氧微生物 都需要以生物素为生长因子 我国所用菌种 北京棒状杆菌ASl 299 钝齿棒状杆菌ASl 542 HU7251及7338 B9等 在正常情况下谷氨酸发酵产酸率可达4 6 谷氨酸对糖的转化率为40 50 菌种扩大培养 1 斜面培养 一般采用牛肉膏蛋白胨培养基 pH7 0 7 2 32 培养18 24h 冰箱保存 2 一级种子培养 采用液

32、体培养基 由葡萄糖 玉米浆 尿素 磷酸氢二钾 硫酸镁 硫酸铁及硫酸锰等组成 pH为6 5 6 8 在三角瓶内32 振荡培养12h 贮存于4 冰箱 3 二级种子培养 培养基除用水解糖代替葡萄糖外 其他与一级种子培养基相仿 在种子罐内32 通气搅拌培养7 10h 即可移种或冷却至10 备用 种子的质量要求 镜检 菌体健壮 排列整齐 大小均一 呈单个或八字形排列 染色性 革兰氏阳性 二级种子的活菌浓度要求达到108 109个 ml 种子活力旺盛平板检查 菌落淡黄色 中间隆起 表面湿润 有光泽 边缘整齐 呈半透明状 小摇瓶发酵试验 产酸稳定并在高峰 28 5 3谷氨酸发酵生产 发酵初期 菌体生长迟滞

33、约2 4h后进入对数生长期 代谢旺盛 糖耗快 这时必须流加尿素以供给氮源并调节培养液的pH至7 5 8 0 温度为30 32 此阶段主要是菌体生长 几乎不产酸 菌体内生物素含量由丰富转为贫乏 时间约12h 发酵中期 进入谷氨酸合成阶段 此时菌体浓度基本不变 糖与尿素分解后产生的 酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸 这一阶段应及时流加尿素提供氨以维持谷氨酸合成的最适pH7 2 7 4 需要大量通气 并将温度提高到谷氨酸合成的最适温度34 37 发酵后期 菌体衰老 糖耗慢 残糖低 需减少流加尿素量 当营养物质耗尽 谷氨酸浓度不再增加时 及时放罐 发酵周期约为30h 28 5 4谷氨酸发酵条件的控制 温

34、度 生长30 32 产酸34 37 pH值 发酵前期pH7 5左右 发酵中 后期pH7 2左右菌龄及接种量 接种对数期生长的种子 接种量一般为 通风量与搅拌速度 菌体生长期小通风 谷氨酸产生期加大通气量 磷酸盐 浓度不能太高 否则向缬氨酸发酵 谷氨基酸发酵的代谢控制 提高谷氨酸发酵产率的措施 1 选育高产菌种 菌体自发突变 物理化学诱变 体外DNA重组 原生质体融合等 高产菌株应具有的特点 丧失 酮戊二酸脱氢酶的氧化能力 谷氨酸脱氢酶活力高 氧化还原氨基化反应强 CO2固定反应强 异柠檬酸脱氢酶活力强 不分解和利用谷氨酸 耐高糖 高浓度的谷氨酸 2 根据菌种特性控制最适宜的发酵条件 3 追加糖

35、化法低糖浓度 大接种量使菌体迅速生长 发酵期追加糖 维持一定的糖浓度 加大产酸和转化率 谷氨酸发酵污染噬菌体后的异常现象 发酵液OD值在初期开始上升 而后又下降或不上升 发酵液pH逐渐上升 4 8h内可达8 0以上 且不下降 不耗糖或耗糖缓慢 泡沫大 黏度大 有时成胶状 可拔丝 发酵周期长 产酸低或不产酸 镜检时 菌体减少 缺少八字排列 菌体变胖 革兰氏染色呈红色片状 严重时呈网状或鱼翅状 几乎看不到完整细胞 发酵中后期 周期稍延长 温度缓慢升 谷氨酸产量有所提高 菌体破裂时放出谷氨酸所致 平板检查时有噬菌斑 摇瓶发酵发酵液稀而清 发酵液残糖高 颜色浑 发灰 发红 有刺激性臭味 黏度大 泡沫多

36、 难中和 过滤困难 28 5 5谷氨酸提取 谷氨酸发酵液的性质34 36 pH6 0 7 5 外观呈浅黄色浆状 表面浮有少量少许泡沫 组成如下 1 L 型谷氨酸 2 无机盐 残糖 色素 尿素 消泡剂 3 大量菌体 蛋白质等固形物质 4 少量发酵副产物 5 0 6 0 8 的铵粒子 1 的残糖 6 核苷酸类物质及其降解产物 谷氨酸提取有等电点法 离子交换法 金属盐沉淀法 盐酸盐法和电渗析法 及两方法结合使用国内多采用的是等电点 离子交换法 谷氨酸的等电点为pH3 22 将发酵液用盐酸调节pH到3 22 谷氨酸就可结晶析出 晶核形成的温度一般为25 30 为促进结晶 需加入型晶种育晶2h 等电点搅

37、拌之后静置沉降 再用离心法分离即可得到谷氨酸结晶 等电点法提取了发酵液中的大部分谷氨酸 剩余的可用离子交换法进一步分离提纯和浓缩回收 谷氨酸是两性电解质 故与阳性或阴性树脂均能进行交换 当溶液pH低于3 2时 谷氨酸带正电 能与阳离子树脂进行交换 国内多用国产732型强酸性阳离子交换树脂来提取谷氨酸 然后在65 左右 用NaOH溶液洗脱 pH3 7的洗脱液返回等电点法提取 等电点法提取谷氨酸 P213图8 2影响谷氨酸结晶析出的主要因素 1 谷氨酸含量 4 8 2 温度及降温速度 结晶温度要低于30 降温要缓慢 3 加酸 前期加酸可以稍快 中后期加酸要缓慢 使pH缓慢降到等电点pI3 22为止

38、 4 投晶种与育晶 根据发酵液中谷氨酸含量和pH来确定投种时间 投种量一般为发酵液的0 2 0 3 5 搅拌 搅拌可以减少结晶粒子的互相黏接 避免晶簇的形成 一般以20 30r min为宜 6 菌体 发酵液中残存菌体的大小及多少 因菌种不同而异 优点 操作 设备简单 一次收率达60 左右 缺点 周期长 占地面积大 离子交换法提取谷氨酸 当发酵液的pH低于3 22时 Glu以阳离子存在 可用阳离子交换树脂来提取 特点 过程简单 周期短 设备省 占地少 提取总回收率可达80 90 缺点 是酸碱用量大 废液污染环境 p213图8 3 28 5 6由GlU制成味精 28 4 6 1谷氨酸的中和 脱色和

39、除铁 1 谷氨酸的中和用氢氧化钠或纯碱中和成谷氨酸钠 工艺参数 湿谷氨酸 水 1 2 湿谷氨酸 纯碱 1 0 3 0 4 中和温度 夏天为60 冷天为65 中和液浓度为21 23oBe 反应pH为6 7 7 0 2 中和液的除铁硫化钠法 树脂法 消除污染 改善条件 提高质量 是一种理想方法 3 中和液的脱色 物理吸附 活性炭脱色 化学脱色 离子交换树脂脱色法 28 5 6 2中和液的浓缩和结晶 1 中和液的浓缩 浓缩的两种方法 一是降低溶液的温度 二是在温度不变 蒸发掉溶液中的一部分水 减压浓缩工艺 真空度 80KPa 温度为65 70 2 谷氨酸钠结晶的析出结晶味精的要求 颗粒大小均匀 透明 光洁 结晶的基本过程 浓缩 起晶 整晶 育晶 放罐等